EBV-LMP2A诱导鼻咽癌细胞EMT和对其生物学特性的影响

发布时间：2017-09-13 02:50

  本文关键词：EBV-LMP2A诱导鼻咽癌细胞EMT和对其生物学特性的影响

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【摘要】：EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)属于人类疱疹病毒γ家族,与鼻咽癌的发病密切相关,研究证实,95%以上未分化型鼻咽癌组织中都可以检测出EB病毒感染,鼻咽癌细胞的EB病毒感染类型属于潜伏感染Ⅱ型,即仅表达低免疫原性EB病毒核抗原1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)、潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein-1,LMP1)和潜伏膜蛋白2(Latent membrane protein-2,LMP2)。研究发现EBV感染的鼻咽癌患者中有95%的患者LMP2A的m RNA水平检测是阳性,其中50%患者LMP2A蛋白表达水平检测是阳性的;然而在EBV感染的鼻咽癌患者中只有65%的患者LMP1的m RNA水平检测是阳性,其中35%的患者LMP1蛋白表达水平检测是阳性的,由此可见无论在基因水平还是蛋白水平LMP2A的表达水平都比LMP1高。因此,EB病毒编码LMP2A与LMP1相比,可能在鼻咽癌发生发展中发挥更为重要的作用,是鼻咽癌发病机制研究的重点,也是寻找鼻咽癌早期诊断、治疗新方法、判断预后的突破点。目的1,构建及鉴定EB病毒编码LMP2A基因重组慢病毒载体及在鼻咽癌细胞中的表达;2,探讨LMP2A与鼻咽癌细胞上皮间质转化的关系;3,探讨LMP2A与鼻咽癌生物学特性的关系。研究方法:1,构建重组慢病毒p LMP2A,采用PCR扩增LMP2A基因,提取plv-GFP质粒,Bam H I与Mlu I双酶切LMP2A基因和plv-GFP质粒,酶切产物经琼脂糖凝胶回收后进行连接、转化,用LB氨苄平板培养过夜,得到重组慢病毒载体p LMP2A,经PCR、重组质粒电泳和双酶切进一步鉴定;2,将重组慢病毒载体p LMP2A、pdelta-8.91、p VSVG重组慢病毒载体包装系统共转染293T细胞,转染48 h后收集病毒上清液;将感染复数(MOI值)为10的重组慢病毒LV-LMP2A加入CNE1细胞培养板中,得到LV-LMP2A-CNE1细胞;同样的方法得到空载转染组LV-CNE1细胞。经单克隆筛选后,采用RT-PCR、wetern blot、免疫荧光检测LMP2A在人鼻咽癌细胞株CNE1中的表达。3,采用wetern blot和免疫荧光检测LV-LMP2A-CNE1细胞和LV-CNE1细胞中EMT相关分子(E-cadherin、vimentin和N-cadherin)的蛋白表达;4,采用CCK8法检测LMP2A对鼻咽癌增殖特性的影响;采用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测LMP2A对鼻咽癌细胞迁移和侵袭特性的影响;采用细胞平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验检测LMP2A对鼻咽癌细胞锚定靶向作用和非锚定靶向作用的影响,采用流式细胞仪检测LMP2A对鼻咽癌细胞凋亡特性的影响。结果:1,将得到的重组慢病毒载体p LMP2A,进行内切酶Bam HⅠ和MluⅠ双酶切,然后进行凝胶电泳,结果显示重组质粒能被完全切开,在1500bp处出现目的基因片段;2,RT-PCR、Western blot、免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A;3,western blot和免疫荧光结果显示LMP2A基因能够促进N-cadherin和vimentin的表达,而抑制E-cadherin的表达;4,CCK8结果显示LMP2A能够促进鼻咽癌细胞增殖;划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验结果显示LMP2A能够促进鼻咽癌细胞迁移和侵袭;细胞克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验结果显示LMP2A能够增强鼻咽癌细胞的锚定靶向作用和非锚定靶向作用;流式细胞仪结果显示LMP2A能够抑制鼻咽癌细胞的凋亡。结论:1,成功构建了高表达LMP2A鼻咽癌细胞株LV-LMP2A-CNE1细胞;2,LMP2A基因能够诱导上皮间质转化(EMT);3,LMP2A基因能够促进鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡。
【关键词】：鼻咽癌 LMP2A EMT
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 高表达EB病毒编码LMP2A基因鼻咽癌细胞株的构建及鉴定13-28
• 前言13
• 材料与方法13-23
• 结果23-26
• 讨论26-28
• 第二部分 LMP2A诱导鼻咽癌细胞上皮间质转化和对其生物学特性的影响28-44
• 前言28
• 材料与方法28-35
• 结果35-41
• 讨论41-44
• 小结44-45
• 参考文献45-49
• 文献综述49-61
• 参考文献55-61
• 附录1 英文缩写词表61-63
• 附录2 在读期间参与工作63-64
• 致谢64

【参考文献】

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1 甄永苏;;抗体药物与肿瘤靶向治疗[J];医学研究杂志;2007年02期

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本文编号：841101