角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜发病中的作用

发布时间：2017-09-18 12:37

  本文关键词：角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜发病中的作用

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【摘要】：目的:探讨正常角膜和圆锥角膜基质细胞中氧化应激水平、Nrf2-ARE信号通路活化的区别,及其对角膜基质降解酶表达水平的影响。方法:1、收集2012年11月至2013年6月在青岛眼科医院行角膜移植的圆锥角膜患者的角膜样本,以及供体正常的旁中央角膜样本,用Dispase和collagenase联合消化法,组织块分离培养正常角膜和圆锥角膜基质细胞,培养液均为DMEM/F-12(含10%胎牛血清),传代限制在P4以内,采用200μM H2O2处理模拟氧化应激微环境。2、根据实验需要设定不同培养条件,将正常角膜和圆锥角膜基质细胞分为4组:①正常角膜对照组(HCF-CON):正常角膜基质细胞常规培养;②正常角膜氧化应激组(HCF-H2O2):采用200μM H2O2处理正常角膜基质细胞;③圆锥角膜对照组(KCF-CON):圆锥角膜基质细胞常规培养;④圆锥角膜氧化应激组(KCF-H2O2):采用200μM H2O2处理圆锥角膜基质细胞。3、细胞内活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的活性采用DCFH-DA荧光底物孵育法检测。4、细胞核内Nrf2蛋白、Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化蛋白和尿激酶型纤溶酶原激活物系统表达水平分别采用免疫蛋白印迹(Western blot)法和实时定量PCR(Real-time qPCR)方法进行检测。5、细胞离心沉淀和培养基上清中基质金属蛋白酶(MMPs)活性采用明胶酶谱技术检测。结果:1、正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强于正常角膜基质细胞;经体外氧化应激刺激后,两组ROS荧光强度均有增强,但圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强度明显强于正常角膜基质细胞。2、正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞核内Nrf2蛋白表达水平明显高于正常角膜基质细胞(t=18.155,P0.01);在H2O2处理条件下,正常角膜基质细胞Nrf2核转位表达水平明显增高(t=50.867,P0.01),但圆锥角膜基质细胞Nrf2核转位表达水平受到抑制(t=62.123,P0.01)。3、正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞抗氧化基因还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化还原酶1(NQO-1)、血红素氧合酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA表达和蛋白表达水平显著低于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义(NQO-1:t=9.315,P0.01;HO-1:t=13.555,P0.01;SOD2:t=7.379,P0.01)。在H2O2处理条件下,Nrf2-ARE信号通路下游基因NQO-1、HO-1、SOD2表达量未见明显变化(NQO-1:t=2.209,P=0.092;HO-1:t=0.293,P=0.784;SOD2:t=0.749,P=0.495)。4、在任何处理条件下,圆锥角膜基质细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、uPA受体(uPAR)表达量和MMP-2活性均明显高于正常细胞(uPA:t=19.164,P0.01;uPAR:t=15.458,P0.01;MMP-2:t=4.818,P0.01)。结论:圆锥角膜基质细胞在Nrf2-ARE信号通路活化方面存在缺陷,且这种缺陷与其表达基质降解酶的水平密切相关,说明该通路异常可能是圆锥角膜发病的机制之一。
【关键词】：圆锥角膜 核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件信号通路 角膜基质细胞 氧化应激
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 缩略词表2-3
• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 引言9-11
• 第一章 资料与方法11-30
• 1.1 实验样本11
• 1.1.1 样本来源11
• 1.1.2 样本分组11
• 1.2 实验仪器与耗材11-13
• 1.2.1 实验仪器11-12
• 1.2.2 实验耗材12-13
• 1.3 实验试剂及主要溶液配制13-16
• 1.3.1 主要实验试剂13-14
• 1.3.2 待测基因的PCR引物序列14-15
• 1.3.3 主要溶液的配制15-16
• 1.4 人角膜基质细胞（HCF）和圆锥角膜基质细胞（KCF）的传代培养及处理16-18
• 1.4.1 原代角膜基质细胞的培养步骤16
• 1.4.2 角膜基质细胞的传代16-17
• 1.4.3 角膜基质细胞的冻存17
• 1.4.4 角膜基质细胞的复苏17-18
• 1.4.5 模拟氧化应激条件的处理18
• 1.5 细胞内活性氧自由基（ROS）检测18
• 1.6 实时定量PCR（RT-qPCR）检测法18-21
• 1.6.1 样品制备18
• 1.6.2 总RNA的提取18-19
• 1.6.3 测定RNA浓度19
• 1.6.4 反转录合成cDNA第一链19-20
• 1.6.5 荧光实时定量PCR技术20-21
• 1.7 Western Blot检测法21-25
• 1.7.1 细胞总蛋白的提取21
• 1.7.2 细胞核-质蛋白的分离提取21-22
• 1.7.3 BCA法测蛋白浓度22-23
• 1.7.4 配制SDS-PAGE凝胶23-24
• 1.7.5 加样及电泳24
• 1.7.6 湿法转膜24
• 1.7.7 免疫反应（目的蛋白特异性结合抗体）24-25
• 1.8 明胶酶谱技术25-28
• 1.8.1 实验用试剂的配制25-27
• 1.8.2 样本的收集27
• 1.8.3 加样与电泳27-28
• 1.8.4 明胶酶谱反应28
• 1.8.5 明胶酶谱的保存28
• 1.9 统计学分析方法28-30
• 第二章 实验结果30-38
• 2.1 细胞培养30-31
• 2.2 细胞内ROS检测31
• 2.3 细胞核内Nrf2蛋白水平检测31-32
• 2.4 Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化蛋白表达检测32-35
• 2.5 基质降解相关蛋白的检测35-38
• 第三章 讨论38-40
• 第四章 结论40-41
• 参考文献41-43
• 综述43-53
• 参考文献48-53
• 攻读学位期间的研究成果53-54
• 致谢54-55

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本文编号：875617