炎症体对肝脏天然免疫的调控及机制研究

发布时间：2017-10-10 00:31

  本文关键词：炎症体对肝脏天然免疫的调控及机制研究

  更多相关文章： 炎症体 缺血再灌注 凋亡 肝细胞 血必净 特利加压素

【摘要】：炎症体(inflammasome)在肝脏损伤的过程中被激活是一常见的病理生理过程,但其在肝脏损伤发生中的具体机制尚不清楚,我们通过建立两个肝脏损伤模型—缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,IRI)和胆总管结扎(Bile duct ligation,BDL)模型,验证了NLRP3(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recuritment domain(ASC)NACHT domain,leucine-rich repeat[LRR]domain,and pyrin domain[PYD]-containing protein-3,NLRP3)炎症体在以上两个肝脏损伤模型中均被激活。随后我们应用两种药物从不同方面阐述了它们对天然免疫的调控作用。中国传统中药制剂血必净注射液(Xuebijing injection,XBJ)已被广泛用于各种感染性疾病或炎症相关疾病的治疗,但是它的抗炎作用的分子机制在很大程度上仍然是不清楚的。在目前的研究中,我们发现,血必净可以明显改善小鼠肝脏缺血-再灌注损(ischemia-reperfusion,IR)伤,表现为改善肝功能,降低乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙氨酸氨基转氨酶(alanine transaminase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST),减少炎症反应和肝细胞的凋亡。值得注意的是,在小鼠肝脏的IR模型中,即使不存在Kupffer细胞的情况下,血必净也能明显抑制炎性体的活化和白细胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)的产生,提示Kupffer细胞在血必净抑制肝脏IR模型炎症体激活的过程中并不是必须的。这一发现促使我们研究血必净对肝细胞凋亡和炎性反应的直接作用。使用体外过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的肝损伤模型中,我们的数据清楚地表明,血必净有效抑制肝细胞凋亡,以时间和剂量依赖的方式抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)和IL-1β的切割激活。这表明血必净除了其已知的调节核转录因子Kappa-B(nuclear transcription factor Kappa-B,NF-κB)依赖性炎症基因的表达,它对肝细胞炎性体的活化也有直接影响。目前的研究不仅加深了我们对血必净如何改善炎症和细胞凋亡的认识,而且许多临床情况下,如部分肝切除,肝移植等都具有直接现实的指导意义。网络药理学提示血必净与血管加压素V1受体(vasopressin V1 receptor,V1R)有相互作用,特利加压素作为V1R的激动剂,临床上常用于急性静脉曲张破裂出血的治疗,但对于其保肝作用没有具体地研究过。我们对特利加压素治疗前、后终末期肝病患者(end-stage liver diseases,ESLDs)的肝功能进行了评估。在小鼠肝脏的IR模型中,特利加压素降低了ALT、AST,增高了白蛋白(albumin,ALB)水平。抑制了炎症,缓解了肝细胞凋亡,本课题探讨了特利加压素药理作用的分子机制,提出特利加压素可能是终末期肝脏疾病患者治疗的新方法。
【关键词】：炎症体 缺血再灌注 凋亡 肝细胞 血必净 特利加压素
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 缩略语13-17
• 绪论17-19
• 前言19-21
• 材料与方法21-41
• 1、实验动物21
• 2、实验试剂21-22
• 3、实验耗材22
• 4、实验仪器22-23
• 5、实验方法23-41
• 5.1 小鼠肝脏IR模型的建立及干预23-24
• 5.2 BDL模型24
• 5.3 小鼠肝脏血流动力学检测24
• 5.4 肝脏内kupffer细胞的去除24-25
• 5.5 小鼠原代肝细胞的分离和培养25-28
• 5.5.1 液体的配制25-26
• 5.5.2 小鼠原代肝细胞的分离26-27
• 5.5.3 小鼠原代肝细胞的计数27
• 5.5.4 小鼠原代肝细胞的培养27-28
• 5.6 小鼠原代肝细胞的刺激和处理28
• 5.7 体外肝细胞的缺氧-复氧（hypoxia/reoxygenation ，HR) 实验28
• 5.8 小鼠原代肝细胞培养上清蛋白的浓缩28-29
• 5.9 肝脏损伤的评估29-30
• 5.9.1 ALT和AST的检测29
• 5.9.2 TBIL的检测29-30
• 5.10 肝细胞损伤的评估30
• 5.11 提取肝脏组织的RNA30-31
• 5.12 肝细胞RNA的提取31
• 5.13 定量的实时聚合酶链式反应（RT-PCR）31-32
• 5.14 半定量RT-PCR32-33
• 5.15 肝脏组织蛋白的提取33
• 5.16 肝细胞蛋白的提取33-34
• 5.17 蛋白浓度的检测（BCA法）34-35
• 5.18 免疫印迹（Western Blot）实验35-36
• 5.19 酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）36
• 5.20 苏木精—伊红（hematoxylin and eosin,ＨＥ）染色36-37
• 5.21 免疫组织化学（Immunohistochemistry，，IHC）37-38
• 5.22 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTPdigoxigenin nick-end labeling，TUNEL）38
• 5.23 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）测定38-40
• 5.24 临床资料收集40
• 5.25 统计分析40-41
• 结果41-102
• 1、不同肝损伤的模型中炎症体的激活情况41-46
• 1.1 BDL模型炎症体激活的情况41-44
• 1.2 缺血再灌注对肝脏炎NLRP3症体的激活44-46
• 2、NLRP3和caspase-1 基因敲除缓解了小鼠BDL引起的肝功能损伤46
• 3、血必净通过抑制NLRP3炎症体的激活缓解小鼠肝脏IRI46-55
• 3.1 血必净减轻了小鼠肝脏IR后肝组织的坏死47-48
• 3.2 血必净缓解小鼠肝脏IR后血清转氨酶的升高48
• 3.3 血必净减轻小鼠肝脏IRI后凋亡的发生48-50
• 3.4 血必净抑制了小鼠肝脏IR后的炎症基因的表达50-51
• 3.5 血必净抑制了小鼠肝脏IR后的血清中炎症细胞因子的表达51-52
• 3.6 血必净抑制了小鼠肝脏IR后的肝脏中性粒细胞的浸润52-53
• 3.7 血必净抑制了小鼠肝脏IR后肝脏中MPO的活性53
• 3.8 血必净抑制了小鼠肝脏IR后肝脏中巨噬细胞的浸润53-54
• 3.9 血必净抑制了小鼠肝脏IR后肝脏炎症体的激活54-55
• 4、鉴别肝细胞和Kupffer细胞在肝脏IR中的作用55-62
• 4.1 血必净在Kupffer细胞清除的条件下仍能明显减少了肝脏的坏死57-58
• 4.2 在Kupffer细胞清除的条件下血必净仍能缓解了小鼠肝脏IR后血清转氨酶的升高58-59
• 4.3 在清除kupffer细胞的条件下，血必净仍能减轻小鼠肝脏IR后凋亡的发生59-60
• 4.4 在清除kupffer细胞的条件下，血必净抑制了小鼠肝脏IR后的炎症基因的表达60-61
• 4.5 在清除kupffer细胞的条件下，血必净抑制了小鼠肝脏IR后肝脏炎症体的激活61-62
• 5、肝细胞的分离培养62-72
• 5.1 血必净抑制了H2O2诱导的肝细胞损伤62-68
• 5.1.1 血必净浓度依赖性减少了H2O2引起的肝细胞LDH的释放62-63
• 5.1.2 血必净浓度依赖性减少了H2O2诱导的肝细胞凋亡63-64
• 5.1.3 血必净浓度依赖性减少了H2O2诱导的肝细胞炎症相关基因的表达64-65
• 5.1.4 血必净时间依赖性减少了H2O2引起的肝细胞LDH的释放65-66
• 5.1.5 血必净时间依赖性减少了H2O2引起的肝细胞的凋亡66-67
• 5.1.6 血必净在基因水平时间依赖性降低了H2O2引起的肝细胞炎症细胞因子的表达67-68
• 5.2 血必净抑制了H2O2诱导的肝细胞NLRP3炎症体的激活68-72
• 5.2.1 血必净浓度依赖性的抑制了H2O2诱导的肝细胞IL-1β 的分泌68-69
• 5.2.2 血必净浓度依赖性的抑制了H2O2诱导的肝细胞NLRP3炎症体的激活69-70
• 5.2.3 血必净时间依赖性的抑制了H2O2诱导的肝细胞IL-1β 的分泌70-71
• 5.2.4 血必净时间依赖性的抑制了H2O2诱导的肝细胞NLRP3炎症体的激活71-72
• 6、网络药理学寻找新的药物靶点72-73
• 7、特利加压素改善了终末期肝病患者的肝功能73-75
• 8、特利加压素减轻了小鼠IR引起的肝损伤75-102
• 8.1 特利加压素减轻了小鼠IR引起的肝坏死75-77
• 8.2 特利加压素减轻了小鼠IR引起的炎症反应77-80
• 8.3 特利加压素减轻了小鼠IR引起的凋亡80-83
• 8.4 特利加压素的肝脏保护作用是TLR4依赖性的83-85
• 8.5 特利加压素治疗对小鼠体内肝血流量没有影响85-87
• 8.6 小鼠肝脏IR对加压素及其受体的影响87-88
• 8.7 体外HR对肝细胞V1R表达的影响88-89
• 8.8 赖氨酸加压素缓解了体外HR引起的肝细胞损伤89-92
• 8.9 赖氨酸加压素透过抑制TLR4缓解了体外HR引起的肝细胞损伤92-93
• 8.10 赖氨酸加压素透过V1R激活了Wnt/β-catenin/SGK/FoxO3a通路发挥其肝细胞的保护作用93-102
• 讨论102-120
• 1、NLRP3炎症体的激活102-106
• 2、kupffer在肝脏损伤中的作用106-109
• 3、肝细胞在IR的作用109-110
• 4、TLRs在IR中的作用110-111
• 5、血必净的药理作用111-114
• 6、Wnt信号通路在肝脏中的作用114
• 7、特利加压素的药理作用114-120
• 结论120-121
• 参考文献121-137
• 致谢137-138
• 读博期间学术论文和科研成果目录138-139

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