利巴韦林通过增强浆细胞样树突状细胞活化发挥抗丙型肝炎病毒的作用

发布时间：2017-10-13 12:03

  本文关键词：利巴韦林通过增强浆细胞样树突状细胞活化发挥抗丙型肝炎病毒的作用

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【摘要】：在过去的几十年中,利巴韦林成为治疗慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)的主要药物。与干扰素单独疗法相比,利巴韦林联合干扰素疗法可使持续病毒学应答(sustained virological response,SVR)显著上升。随着DAAs的出现,HCV的治疗已进入无干扰素时代。目前DAAs临床试验显示,利巴韦林仍不可或缺。然而,利巴韦林抗HCV的作用机制至今尚不明确。最近研究表明,利巴韦林联合DAA-sofosbuvir可恢复HCV患者体内内源性IFNa-2的分泌。但是目前尚不清楚哪种细胞类型使得内源性IFNa-2分泌恢复,利巴韦林是否参与此过程。在感染的肝细胞中,HCV的NS3-4A通过清除MAVS和TRIF而阻断I型干扰素生成。因此,在感染的肝脏中,未感染的肝细胞或其他细胞可能是IFN-I的来源。在这些细胞中,p DCs是人体内IFN-I主要生成细胞。体外研究表明,HCV感染肝细胞可以通过细胞接触的方式启动TLR-7介导的p DCs激活,产生大量IFN-I。在HCV患者接受利巴韦林治疗的过程中,p DCs会受到HCV感染肝细胞及利巴韦林的作用。因此,我们提出假设,利巴韦林通过调节p DCs的活化状态,发挥抗HCV的作用。本课题将从两部分展开研究:第一部分利巴韦林调节p DCs活化状态研究。采用p DC-Gen2.2细胞系,首先使用TLR7或TLR9配体R848、Cp GA/B激活p DCs,然后加入不同浓度的利巴韦林,测定不同时间点IFN-a水平及细胞内IFN-a,IFN-β表达水平,观察利巴韦林对p DCs活化状态的调节;使用FACS检测单个细胞水平IFN-a的变化;使用TLR9配体Cp G A分别作用于PBMCs、p DC-depleted PBMCs,观察IFN-a分泌情况。为了研究利巴韦林调节p DCs活化的作用机制,检测利巴韦林对p DC的IRF-7及其他转录因子(IRF-9和STAT1)及ISGs表达的影响;采用p DC-Gen2.2细胞系,刺激前使用IFNAR-Ab处理细胞,观察IFNAR-Ab对利巴韦林作用的影响;实验结果如下:所有的配体(R848/Cp GA/Cp GB)均可激活p DC-Gen2.2产生IFN-a。利巴韦林单独不能刺激该细胞分泌IFN-a,但可使TLR7、TLR9介导的IFN-a分泌增加1倍,并且该作用具有时间依赖性和浓度依赖性;利巴韦林和Cp GA同时刺激p DC-Gen2.2可使IFN-a、IFN-β表达水平升高,但对IFN-γ、IL-29、IL28B表达无影响。使用FACS检测显示,在单个细胞水平上,利巴韦林可促使Cp GA介导的IFN-a分泌增加。使用Cp G A刺激PBMCs,可以得到与p DC-Gen2.2一致的结果;但p DCdepleted PBMCs对Cp G A反应性显著降低。在p DC-Gen2.2细胞中,与IFNAR-Ab未处理组相比,IFNAR-Ab处理组的IFN-a分泌水平普遍降低,但利巴韦林仍可使Cp GA介导的IFN-a分泌增加。在m RNA水平上,利巴韦林使经Cp GA刺激后的p DC-Gen2.2表达IRF-7、IRF-9和STAT1及TRIM22、PKR 5和OAS-1增加。第二部分利巴韦林通过调节p DCs活化状态抑制HCV的研究本部分使用H77S.3/Gluc2A感染细胞,在该感染细胞内HCV RNA可活跃复制,检测Gluc能反应HCV RNA复制水平。首先检测该细胞系对不同浓度外源性干扰素的反应性;其次,检测H77S.3/Gluc2A感染细胞与p DC-Gen2.2共培养能否激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a并抑制HCV RNA复制;最后检测利巴韦林/Cp G A激活的p DC-Gen2.2能否有效抑制H77S.3/Gluc2A感染细胞中HCV RNA的复制,并研究其相关因素。实验结果如下:10u/ml-1000u/ml干扰素均可有效抑制H77S.3/Gluc2A感染细胞中HCV RNA的复制。在第3天,10u/ml干扰素可抑制HCV RNA复制达50%,100u/ml和1000u/ml也可达到同等抑制水平。利巴韦林单独不能抑制HCV RNA复制。在H77S.3/Gluc2A感染细胞与p DC-Gen2.2共培养系统中,Cp G A可有效激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a,并抑制HCV RNA复制;加入利巴韦林,可使该系统内IFN-a分泌增加,HCV RNA复制抑制效果更明显。综上所述,我们发现利巴韦林单独不能激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a,但是可促使TLR7/TLR9介导的IFN-a表达增加。使用H77S.3/Gluc2A感染细胞,建立H77S.3/Gluc2A感染细胞和p DC-Gen2.2共培养系统,我们发现利巴韦林单独不能抑制HCV RNA复制,但是明显增强了p DCs抑制HCV RNA复制的功能。这些研究证实了利巴韦林通过增强p DCs活化和IFN-a分泌发挥抗HCV的作用。
【关键词】：丙型肝炎 利巴韦林 浆细胞样树突状细胞 I型干扰素
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-15
• 第1章 绪论15-37
• 1.1 利巴韦林在丙肝治疗中的重要地位15-24
• 1.1.1 利巴韦林概述15
• 1.1.2 利巴韦林联合干扰素是治疗丙型肝炎的标准方案15-17
• 1.1.3 干扰素及利巴韦林抗病毒作用机制17-21
• 1.1.4 利巴韦林在无干扰素时代仍不可或缺21-24
• 1.2 浆细胞样树突状细胞24-34
• 1.2.1 浆细胞样树突状细胞概述24-30
• 1.2.2 浆细胞样树突状细胞与丙型肝炎30-34
• 1.3 本研究使用HCV-1A细胞系-H77S.3/GLUC2A感染细胞34-35
• 1.4 本研究的目的和意义35-37
• 第2章 利巴韦林调节浆细胞样树突状细胞活化状态的研究37-71
• 2.1 实验材料37-38
• 2.1.1 细胞株37
• 2.1.2 主要试剂37-38
• 2.1.3 主要仪器38
• 2.2 实验方法38-51
• 2.2.1 利巴韦林增强TLR7/9 介导的pDC-Gen2.2 细胞激活38-43
• 2.2.2 pDCs是PBMCs中主要的IFN-a分泌细胞43-47
• 2.2.3 利巴韦林增强p DCs活化的作用机制研究47-50
• 2.2.4 统计分析50-51
• 2.3 实验结果51-67
• 2.3.1 利巴韦林增强TLR7/9 介导的pDC-Gen2.2 细胞激活51-60
• 2.3.2 pDCs是PBMCs中主要的IFN-a分泌细胞60-63
• 2.3.3 利巴韦林增强p DCs活化的作用机制研究63-67
• 2.4 讨论67-71
• 第3章 利巴韦林调节PDCS活化状态对HCV复制的影响71-83
• 3.1 材料和方法71-72
• 3.1.1 细胞株71
• 3.1.2 主要试剂71
• 3.1.3 主要仪器71-72
• 3.2 实验方法72-76
• 3.2.1 检测H77S.3/Gluc2A感染细胞对IFN-a及利巴韦林的敏感性72-74
• 3.2.2 检测利巴韦林、pDC-Gen2.2 对HCV RNA的影响74-75
• 3.2.3 统计分析75-76
• 3.3 实验结果76-80
• 3.3.1 利巴韦林对Huh7.5 细胞活力的影响76
• 3.3.2 H77S.3/Gluc2A感染细胞对IFN-a及利巴韦林的敏感性76-78
• 3.3.3 利巴韦林/Cp GA、pDC-Gen2.2 对HCV RNA影响78-80
• 3.4 讨论80-83
• 结论83-85
• 本实验创新点85-87
• 参考文献87-104
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果104-105
• 致谢105

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