PTP1B在肝纤维化形成及逆转过程中的作用研究

发布时间：2017-10-13 18:04

  本文关键词：PTP1B在肝纤维化形成及逆转过程中的作用研究

  更多相关文章： 肝纤维化 逆转 肝星状细胞 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是多种慢性致病因子作用于肝脏后,引起的以细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)沉积为主要特征的可逆性损伤修复反应。持续的肝纤维化是肝硬化和肝癌的主要病因。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化是肝纤维化的发生发展的核心事件。研究表明,当去除病因后,肝纤维化可以自发逆转,其逆转的主要机制主要是活化的HSCs凋亡和失活。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)是一种广泛表达的、经典的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶,由蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1, PTPN1)基因编码表达。研究显示,PTP1B在肝脏再生、急性肝损伤、脂肪肝等肝脏疾病当中,发挥重要作用。但是其在肝纤维化中的作用还未见报道。为了深入研究PTP1B在肝纤维化中的作用,本课题首先检测了其在肝纤维化进展期及逆转期肝组织的表达变化。并选用HSC-T6细胞株为实验对象,分别检测PTP1B在HSC活化及逆转失活过程中的表达变化及作用。本文主要研究内容包括下面三个部分：1. PTP1B在肝纤维化形成及逆转过程中的变化36只昆明小鼠(雄性,4周龄,20-22g),随机分为正常对照组、肝纤维化模型组和肝纤维化逆转组,每组12只。模型组小鼠腹腔注射20% CCl4橄榄油溶液(0.01 ml/g)以建立肝纤维化模型,每周2次,共4周；逆转组小鼠在注射CCl4达4周后,停止注射并正常饲养6周以建立肝纤维化自发逆转模型；正常对照组则以同样方法注射等量橄榄油。于CCl4停止注射后0、6周分别处死小鼠,收集血清、肝脏标本待用。HE染色和Masson染色观察肝脏病理改变,并检测血清ALT和AST水平观察肝脏损伤程度。应用Real-time PCR、Western Blot、。免疫组化及免疫荧光检测PTP1B的表达和定位情况。结果显示：PTP1B在肝纤维化肝组织中表达上调,而在纤维化自发恢复后表达降低,且PTP1B主要表达于活化的肝星状细胞中。2. PTP1B对TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞系HSC-T6舌化增殖的影响HSC-T6细胞经不同梯度浓度(0、5、10、15ng/ml；24h)的、不同时间点(0、12、24、48h；10ng/m1)的TGF-β1刺激活化,采用Real-time PCR和Western Blot技术检测PTP1B在活化的HSC中的表达变化。结果显示：PTP1B在TGF-p1诱导活化的HSC-T6中表达上调,并呈剂量/时间依赖性。应用PTP1B-siRNA预处理HSC-T6细胞6h后,再给予TGF-p1(10ng/ml)作用24 h,运用MTT和流式细胞仪检测HSC-T6细胞增殖情况、细胞周期分布和细胞凋亡情况；应用Real-time PCR和Western Blot技术检测HSC-T6中Co11αl和a-SMA的mRNA和蛋白表达情况。结果显示：沉默PTP1B可以抑制TGF-p1诱导的HSC-T6的增殖并使细胞周期阻滞在G0/G1期,但是不影响细胞的凋亡情况；沉默PTP1B可以抑制TGF-β1诱导的HSC-T6的活化,降低Co11αl和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平。3. PTP1B对MDI诱导的大鼠肝星状细胞系HSC-T6失活的影响HSC-T6细胞以TGF-β1(10ng/ml,24h)诱导活化后,除去培养基,更换为含有MDI的培养基继续培养48h。采用Real-time PCR和Western Blot技术检测PTP1B在逆转失活的HSC中的表达变化。结果显示：PTP1B在TGF-β1诱导活化的HSC-T6中表达上调,在MDI诱导失活的HSC-T6中表达下调。HSC-T6细胞以TGF-β1(10ng/ml,24h)活化后,将pCDA3.1-PTP1B质粒转染至细胞中,6h后更换为含MDI的培养基继续培养48h。应用Real-time PCR和Western Blot技术检测HSC-T6中Collα1和a-SMA的mRNA和蛋白表达情况。结果显示：过表达PTP1B可拮抗MDI诱导的HSC-T6的失活,恢复Collα1和a-SMA的表达。
【关键词】：肝纤维化 逆转 肝星状细胞 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中英文缩略词对照6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 1 前言14-15
• 2 实验材料15-20
• 2.1 实验动物和细胞15
• 2.2 主要试剂15-17
• 2.3 仪器与设备17-18
• 2.4 主要试剂和溶液的配制18-20
• 3 实验方法20-36
• 3.1 小鼠动物模型的建立20
• 3.2 小鼠肝组织病理学检测20-22
• 3.3 免疫组化22
• 3.4 免疫荧光双染22-23
• 3.5 血清谷丙转氨酶(ALT)含量测定(微板法)23-24
• 3.6 血清谷草转氨酶(AST)含量测定(微板法)24-25
• 3.7 HSC-T6细胞培养和传代25
• 3.8 MDI诱导已活化的HSC-T6细胞失活25
• 3.9 PTP1B-siRNA转染HSC-T625-26
• 3.10 pCDNA3.1 Flag-rat-PTP1B转染HSC-T6细胞26-28
• 3.11 MTT试验28
• 3.12 细胞周期检测(Propidium染色法)28-29
• 3.13 细胞凋亡检测(Annexin V-FITC/PI双染法)29-30
• 3.14 Real-time PCR实验30-32
• 3.15 Western Blot实验32-35
• 3.16 统计学处理35-36
• 4 结果36-56
• 4.1 PTP1B在纤维化肝组织及逆转肝组织中的表达变化36-41
• 4.2 PTP1B在活化的HSC-T6中的表达水平41-44
• 4.3 PTP1B-siRNA对TGF-β1诱导的HSC-T6增殖的影响44-47
• 4.4 PTP1B-siRNA对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化的影响47-49
• 4.5 PTP1B在MDI诱导逆转的HSC-T6中的表达变化49-52
• 4.6 pCDNA3.1-PTP1B质粒对MDI诱导的HSC-T6失活的影响52-56
• 5 讨论56-59
• 6 结论59-60
• 参考文献60-64
• 附录64-66
• 致谢66-67
• 综述67-98
• References89-98

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