HBV感染食蟹猴肝细胞的研究

发布时间：2017-10-15 10:47

  本文关键词：HBV感染食蟹猴肝细胞的研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可诱发肝炎、肝硬化,甚至肝癌,是严重威胁人类健康的疾病之一。在HBV相关研究中,研究人员建立了一系列HBV感染的细胞和动物模型。虽然这些模型极大地推动了HBV致病机制的研究,并为抗HBV治疗药物的开发做出了不可磨灭的贡献,但是目前应用的HBV感染模型由于缺乏与人类相同的自然感染过程,因此,无论在机制研究还是药物开发应用中,都无法完全胜任。研究发现,钠离子/牛黄胆酸共转运多肽(NTCP)是HBV感染肝细胞的重要功能受体。NTCP迅速成为抗HBV新药研究的重要靶标,同时也为研究建立新型的HBV感染模型提供了靶向。实验研究已证实,表达人NTCP的HepG2细胞和Huh7细胞可被HBV感染。本课题研究中,为探索人NTCP能否介导HBV感染食蟹猴原代肝细胞,首先将人NTCP基因克隆到慢病毒包装载体后包装成慢病毒;然后借助慢病毒将人NTCP导入HepG2和Huh7细胞,细胞DNA和RNA的探针法real-time PCR检测结果和蛋白质水平的蛋白质印迹检测结果表明人NTCP可在细胞内表达;将表达人NTCP的上述细胞与HBV共培养,细胞培养上清HBsAg的ELISA定量结果表明,表达人NTCP的HepG2和Huh7细胞能够被HBV感染。然后,将人NTCP基因借助慢病毒导入食蟹猴原代肝细胞,细胞DNA和RNA的探针法real-time PCR检测结果表明人NTCP不能在肝细胞内表达,可能的原因是食蟹猴NTCP抑制了人NTCP的表达。最后,借助CRISPR/Cas9技术敲除食蟹猴NTCP,并再次将人NTCP导入肝细胞内,细胞DNA和RNA的探针法real-time PCR检测结果表明在敲除食蟹猴NTCP后,人NTCP可以在肝细胞内表达;然后用HBV感染表达人NTCP的肝细胞,细胞培养上清HBsAg的ELISA定量结果表明,表达人NTCP的肝细胞不能被HBV感染。综上,人NTCP可以介导HBV感染HepG2细胞和Huh7细胞,但是不能介导HBV感染食蟹猴原代肝细胞,这提示,NTCP发挥介导HBV感染作用时需要协同因子的共同作用。
【关键词】：NTCP HBV 食蟹猴 原代肝细胞 CRISPR/Cas9
【学位授予单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 缩略词4-5
• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 绪论10-17
• 1.1 细胞模型10-12
• 1.1.1 原代肝细胞模型10-11
• 1.1.2 细胞系模型11-12
• 1.2 动物模型12-16
• 1.2.1 非人灵长类模型12-13
• 1.2.2 小鼠模型13-14
• 1.2.3 其他模型14-16
• 1.3 本研究的目的、意义和主要研究内容16-17
• 1.3.1 本研究的目的、意义16
• 1.3.2 本研究主要研究内容16-17
• 第二章 材料与方法17-44
• 2.1 试验材料17-22
• 2.1.1 获取HBV血清17
• 2.1.2 细胞株17
• 2.1.3 引物和基因合成、质粒、感受态细胞17
• 2.1.4 实验动物17-18
• 2.1.5 主要仪器设备18
• 2.1.6 试剂盒18-19
• 2.1.7 主要试剂及配制19-22
• 2.2 试验方法22-44
• 2.2.1 人NTCP慢病毒载体构建及慢病毒包装22-29
• 2.2.2 人NTCP介导HBV感染HepG2细胞和Huh7细胞29-34
• 2.2.3 食蟹猴原代肝细胞的分离与原代培养34-35
• 2.2.4 人NTCP介导HBV感染食蟹猴原代肝细胞35-36
• 2.2.5 靶向食蟹猴NTCP的gRNA活性筛选及相关慢病毒包装36-41
• 2.2.6 人NTCP介导HBV感染食蟹猴NTCP敲除的原代肝细胞41-44
• 第三章 结果与分析44-60
• 3.1 人NTCP慢病毒载体构建及慢病毒包装44-47
• 3.1.1 人NTCP慢病毒载体构建44-45
• 3.1.2 pLKO.1-hNTCP慢病毒包装45-47
• 3.2 人NTCP介导HBV感染HepG2细胞和Huh7细胞47-51
• 3.2.1 人NTCP介导HBV感染HepG2细胞47-49
• 3.2.2 人NTCP介导HBV感染Huh7细胞49-51
• 3.3 食蟹猴原代肝细胞的分离与原代培养51-53
• 3.4 人NTCP介导HBV感染食蟹猴原代肝细胞53-54
• 3.5 靶向食蟹猴NTCP的gRNA活性筛选及相关慢病毒包装54-57
• 3.5.1 NTCP靶点gRNA活性筛选54-55
• 3.5.2 pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP-U6-gRNAx慢病毒载体构建55-56
• 3.5.3 pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP-U6-gRNAx慢病毒包装56-57
• 3.6 人NTCP介导HBV感染食蟹猴NTCP敲除的原代肝细胞57-60
• 3.6.1 CRISPR/Cas9系统敲除食蟹猴NTCP基因57-58
• 3.6.2 病毒感染食蟹猴NTCP敲除的原代肝细胞58-60
• 第四章 讨论60-63
• 4.1 慢病毒载体包装与感染60
• 4.2 食蟹猴原代肝细胞分离与培养60-61
• 4.3 人NTCP介导HBV感染61-63
• 第五章 总结63-65
• 参考文献65-70
• 发表论文和参加科研情况说明70-71
• 致谢71

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