羟基酚酮类化合物通过封闭HBV RNaseH抑制HBV DNA复制

发布时间：2017-10-15 15:26

  本文关键词：羟基酚酮类化合物通过封闭HBV RNaseH抑制HBV DNA复制

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【摘要】：背景慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重威胁人类健康的一种慢性疾病,世界上每年约有超过一百万患者死于HBV相关疾病。HBV是一种逆转录复制的嗜肝DNA病毒,一般根据基因序列不同将其分为8个基因型(A-H)。目前临床可用的抗HBV感染药物主要有干扰素α和核苷(酸)类似物两大类药物。干扰素临床有效率低且存在较多的副作用限制了临床广泛应用;核苷(酸)类似物能够实现血清表面抗原阴转的比例也仅有3-6%,并且停药后的高复发率,不确切的疗程以及逐渐增加的耐药性等都使其仍然不能成为抗HBV的理想药物。寻找抗HBV新的治疗靶点和开发与现有药物不同作用机制的抗HBV药物仍然是迫切需要解决的课题。催化HBV逆转录过程需要病毒编码的两个关键活性酶,即DNA多聚酶和核糖核酸酶H(Ribonuclease H,RNase H),抑制任何一个都可以抑制HBV DNA的复制。以DNA多聚酶为靶点的核苷类药物能够抑制HBV DNA到临床检测下限以下,然而少量残存的持续低水平病毒复制仍然使得难以彻底清除病毒。如果在抑制DNA多聚酶的同时能抑制RNase H的活性,即有可能最大限度抑制HBV DNA的复制,为耗竭ccc DNA提供可能。而通过体外纯化获得有活性HBV RNase H成为筛选抗HBV RNase H药物的关键之一。从众多的自然和人工化合物中筛选出具有抑制HBV RNase H活性的化合物是开发药物的另一关键。大量研究表明多个托酚酮类化合物对人类免疫缺陷病毒(HIV)RNase H活性具有较强抑制作用。HBV与HIV同属于逆转录病毒,临床上已经证实多个核苷类药物能够同时抑制HIV和HBV的逆转录酶,而HBV RNase H和HIV RNase H同属于核苷酸转移酶超家族,推测部分托酚酮类化合物可能对HBV RNase H也存在抑制作用。目的探索一种能够纯化出有活性HBV RNase H的方法并建立一种HBV RNase H抑制剂的生化筛选体系;筛选出能够通过抑制HBV RNase H进而抑制HBV DNA复制的化合物;研究HBV不同基因型对RNase H活性及RNase H抑制剂敏感性的影响;为开发新型抗HBV药物进行有益探索。方法1构建HBV RNase H和人RNase H1表达质粒。以C端带His标签的p Trc His2B为骨架,分别克隆插入基因合成编码优化的基因D型和C型HBV RNase H序列作为基因D型(HRHLP-gt.D)和基因C型(HRHLP-gt.C)HBV RNase H表达质粒;以质粒p MAL-c5x His为骨架,在MBP下游插入C端带His标签的基因C型HBV RNase H序列,构成N端带MBP和C端带His标签的HBV RNase H(MBP gt.C)表达质粒。以质粒p Rset B为骨架插入基因合成的N端带His标签的人RNse H1基因序列构成人RNase H1表达质粒。2 RNase H的表达和纯化。把基因重组合成构建的HBV RNase H和人RNase H1质粒转化LOBSTR E.coli菌株并进行蛋白表达;采用镍亲和层析法进行蛋白纯化。3蛋白鉴定。SDS-PAGE胶电泳和Western Blot方法鉴定目的蛋白。4 HBV RNase H和人RNase H1酶活性检测。采用寡核苷酸引导的RNA切割测定法检测。长264nt的32P标记的鸭型HBV RNA(DRF+)与一段长20nt的互补DNA寡核苷酸链拟合成部分双链,DRF+双链部分被加入的RNase H降解后成为长短不同的两段,可以通过变性胶电泳和放射自显影方法检测。5托酚酮类化合物对HBV RNase H和人RNase H1酶活性抑制作用筛选。采用寡核苷酸引导的RNA切割测定法共筛选了51个托酚酮类化合物,不同浓度的待测化合物加入反应体系中,具有抑制作用的化合物可以抑制RNase H把DRF+切割成两段。通过变性胶电泳和放射自显影方法检测切割产物,Image J软件定量分析切割产物条带灰度。6托酚酮类化合物对HBV DNA的抑制作用。采用Hep DES19细胞检测HBV DNA的复制。细胞接种于6孔板,培养48小时后加入待测化合物。每天更换新的含待测化合物的培养基。2天后收获细胞,提取细胞内HBV核心颗粒中的HBV DNA。Taq Man PCR分别定量检测HBV DNA正链和负链。7 MTT法细胞毒性检测。Hep DES19接种于96孔板培养;24小时后加入不同浓度的待测化合物,每个浓度设3个复孔,每天更换新的含待测化合物的培养基,2天后加入MTT,继续培养60分钟后,溶解代谢产物,570nm波长检测吸光值。8检测不同基因型HBV RNase H对其抑制剂的敏感性。构建基因B型、C型和D型共18个不同序列HBV RNase H表达质粒,镍亲和层析法纯化不同序列HBV RNase H;寡核苷酸引导的RNA切割法检测不同HBV RNase H的活性和同一HBV RNase H抑制剂(托酚酮化合物#46)对不同HBV RNase H抑制性的差异。结果1 HRHLP-gt.D和HRHLP-gt.C仅有微量表达,Western blot可以检测到纯化的微量蛋白;MBP gt.C表达量丰富,SDS-PAGE胶电泳Coomassie染色和Western blot均可检测到纯化的较高纯度的目的蛋白。2 HRHLP-gt.D、HRHLP-gt.C和MBP gt.C均显示出特异性的酶活性。3纯化的HBV RNase H酶活性在一定温度和时间内具有很好的稳定性。4所筛选的51个托酚酮类化合物中,共有8个化合物只在60μM时对基因D型和(或)C型HBV RNase H具有抑制作用;3个化合物在20μM时对基因D型和(或)C型HBV RNase H具有抑制作用;2个作用最强的化合物(#46和#106)在10μM时对基因D型和C型HBV RNase H同时具有抑制作用。5选取在化合物初筛实验中对基因D型和C型HBV RNase H均有较强抑制作用的6个托酚酮化合物(#46,#106,#107,#110,#112,#113)进行IC50测定。结果显示有4个化合物(#46,#106,#107,#110)的IC50值都小于40μM。6选取共35个托酚酮化合物进行对人RNase H1的作用初筛,其中包括13个对HBV RNase H有抑制作用的化合物和12个对HBV RNase H没有抑制作用的化合物。有4个化合物在10μM时对Hu RH1有抑制作用;14个化合物在60μM或20μM时对Hu RH1有抑制作用;17个化合物在60μM时对Hu RH1没有抑制作用。7托酚酮类化合物在HBV RNase H和Hu RH1之间抑制强弱程度的不同。#46化合物对Hu RH1的IC50值约为对HBV RNase H的10-20倍;#106化合物对Hu RH1的IC50值约为对HBV RNase H的2倍多;#110和#112对Hu RH1和HBV RNase H的IC50值接近;而#113化合物对Hu RH1的IC50值约为对HBV RNase H的1/4。8检测的6个托酚酮化合物对HBV DNA抑制作用的EC50均低于10μM,其中最好的#110 EC50只有0.34μM;在每个检测样本中的负链DNA合成均没有抑制或者只有在化合物浓度很高时才被抑制。计算这些化合物的治疗指数最高的#110达到94。9选取对HBV DNA正链具有选择性抑制作用的6个羟基酚酮类化合物(#46,#106,#110,#112,#113和#56)进行了Hep DES19细胞毒性检测。其CC50值介于25μM到79μM之间。10基因B型、C型和D型及同一基因型不同亚型HBV RNase H之间活性差异具有统计学意义(P0.05);但是不同基因型HBV RNase H对同一HBV RNase H抑制剂(#46)的敏感性没有差异(P0.05)。结论1通过E.coli表达和镍亲和层析法可以获得有活性的多种基因型HBV RNase H。2寡核苷酸引导的RNA切割法可以作为一种低通量HBV RNase H抑制剂体外生化筛选方法。3 HBV RNase H可以作为新的抗HBV药物靶点。4托酚酮类化合物中的羟基酚酮类化合物能够通过抑制HBV RNase H而抑制HBV DNA复制,是一类值得进一步研究开发的新型抗HBV化合物。5不同基因型的HBV RNase H之间活性存在差异;HBV RNase H抑制剂羟基酚酮类化合物#46具有良好的HBV基因型覆盖性。
【关键词】：乙型肝炎病毒 核糖核酸酶H 纯化 羟基酚酮 抑制剂 细胞毒性
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 第一章 引言15-20
• 第二章 HBV RNaseH的表达和纯化20-44
• 1 材料和方法21-37
• 2 结果37-41
• 3 讨论41-44
• 第三章 托酚酮类化合物对HBV RNaseH的抑制作用筛选44-59
• 1 材料和方法45-49
• 2 结果49-55
• 3 讨论55-59
• 第四章 托酚酮类化合物对HBV DNA复制的抑制作用59-73
• 1 材料和方法60-66
• 2 结果66-71
• 3 讨论71-73
• 第五章 不同基因型HBV RNaseH活性及对其抑制剂羟基酚酮类化合物的敏感性73-79
• 1 材料和方法74-75
• 2 结果75-77
• 3 讨论77-79
• 第六章 结论79-81
• 参考文献81-91
• 综述： 乙型肝炎病毒抑制剂研究进展91-108
• 参考文献100-108
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果108-109
• 致谢109

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