胆总管结石患者胆道和阿尔茨海默症小鼠肠道的宏基因组学研究

发布时间：2017-10-15 20:04

  本文关键词：胆总管结石患者胆道和阿尔茨海默症小鼠肠道的宏基因组学研究

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【摘要】：越来越多的证据表明人体微生物组与人类健康和疾病关系密切,这些寄居于人体的微生物通过其代谢产物和免疫调节作用与宿主相互作用,从能量摄取、新陈代谢、免疫系统发育等多个方面对宿主产生深远影响。诸如肥胖、2型糖尿病、炎性肠病等多种疾病均被发现与人体微生物组有相关性。近年来,伴随着新一代高通量测序技术的高速发展,宏基因组测序技术已成为研究微生物群体的重要手段。该技术避免了如微生物培养技术、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增技术和系统发生芯片技术等传统微生物鉴别技术存在的不足,实现了大规模并行测序,测序通量和测序精度更高,其足以描述微生物群体全貌。当前已通过宏基因组测序手段对人类的胃肠道、皮肤、阴道、口腔和鼻腔等多个部位的微生物群体进行了研究,为研究人体微生物组与人类健康和疾病的关系奠定了基础。但是,由于样本采集、数据分析等方面的问题,对于某些特定人类疾病的相关微生物组研究依旧很少,导致我们对相关微生物组的构成、功能及其在疾病发生发展过程中作用的认识还不够深刻。基于宏基因组测序手段,本论文第一、二部分将对前人研究极少的胆总管结石患者胆道微生物菌群进行探索,包括菌群构成、新胆道菌发现、菌群功能基因和胆道菌群同其他上消化道菌群的联系。而在第三部分,作为人类微生物组研究的补充,阿尔茨海默症模型小鼠的肠道微生物组将被初步研究。现有的胆总管结石患者胆道菌群多依赖于微生物培养和PCR扩增技术。当前尚无胆总管结石患者胆道菌群的系统性研究。本论文对15位中国胆总管结石患者的胆总管胆汁样本进行全宏基因组鸟枪法(whole-metagenome shotgun,WMS)测序和16S核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)扩增子测序(简称16S测序)分析。这是首次对胆总管胆汁样本进行的全宏基因组鸟枪法测序研究。平均每个样本得到了7.29Gbp的WMS测序数据,经过质控和比对分析,宿主序列占所有质控后序列的百分比均在98%以上,每个样本包含的细菌序列数介于593和1,242,270之间。基于菌群结构分析和聚类分析,我们发现大部分胆总管结石患者(13/15)依据肠道菌群的丰度可以聚成两大类:一类中既包含口腔、呼吸道细菌,也包含肠道细菌,细菌序列占测序数据的比例介于0.62%和1.66%之间;另一类中以口腔、呼吸道细菌为主,仅包含两个肠道细菌,细菌序列比例介于0.0008%和0.056%之间。因此可以看出,在胆汁样本中,口腔、呼吸道细菌比肠道细菌更为普遍。并且结合样本临床信息,我们发现这两个菌群聚类均与病人的发热状态或经内镜逆行性胰胆管造影术手术史无关。此外,结果表明,胆道菌群具有明显的个体异质性,有许多细菌仅在一位患者(n=77)或两位患者(n=43)的样本中出现。WMS测序和16s测序结果均表明胆汁微生物组的样本内多样性低于健康人肠道菌群的。借助于wms测序的优势,本研究一次就发现了13个之前未报道的胆道细菌,比如鱼腥味锥形杆菌和纤维化纤维微细菌。这些细菌的基因组覆盖度介于1%和33.13%之间,大部分是人类口腔细菌和环境细菌。本研究还从测序数据中鉴别出与胆石形成和胆汁耐受相关的基因,比如编码β-葡萄糖醛酸酶、磷脂酶和多重耐药外排泵蛋白的基因。同时,本研究重构了胆道菌群的代谢通路,并与健康人肠道菌群的通路谱进行了比较,结果表明胆汁样本中炎症、氧化应激和鞭毛组装相关通路丰度上调,但是碳水化合物代谢相关通路却表现出不同的变化模式。为了进一步研究胆道细菌的来源,我们接着对6位胆总管结石患者的胆总管胆汁、十二指肠液、胃液和唾液进行宏基因组分析。基于16srrna扩增子测序,平均每个样本得到了12,299条高质量序列。在23个样本中一共检测到1,398个可操作分类单元(operationaltaxonomicunit,otu)。分析结果表明在胆汁出现的细菌均出现在上消化道中,在门水平鉴定出的7种胆道细菌均能在同一病人的一个或多个上消化道位点中检测到。在属水平,胆汁中出现的53个高丰度细菌也均包含在上消化道菌群中。基于相关性和菌群多样性指标,本研究把胆道菌群与上消化道各取样位点的菌群相比,发现胆道菌群与十二指肠菌群相似度最高。我们还观察到胆道菌群相对于上消化道菌群出现了不同的变化模式。虽然大部分细菌,比如普氏菌属、韦荣球菌属、卟啉单胞菌属和罗氏菌属,在胆汁中的丰度明显降低,但仍有3个肠杆菌科细菌(埃希氏菌属、克雷伯菌属和一种未定义细菌)和锥形杆菌属在胆汁中丰度上升。基于16s测序数据功能预测软件,本研究预测出各取样位点的代谢通路丰度,比较结果表明胆道菌群其环境信息处理能力和细胞活动能力有所增强。此外,涉及到碳水化合物、脂类、氨基酸、核酸、辅助因子和维生素的代谢通路在不同取样位点出现了丰度差异,表明胆道细菌可能与上消化道细菌拥有不同的能量和营养来源。这些结果为胆道细菌可能来自肠道细菌的逆行感染提供了直接证据,并且刻画了胆道环境可能对细菌施加的选择性压力。此外,为了研究阿尔茨海默症相关微生物组,本研究还对散发性阿尔茨海默症小鼠的肠道菌群进行了宏基因组分析,并且验证了中药lw-afc对小鼠认知功能和肠道菌群的影响。morris水迷宫实验、穿梭箱实验和新奇物识别实验等一系列行为学测试实验表明,疾病组samp8小鼠在空间学习和记忆能力、主动回避反应能力及物体识别记忆能力等方面存在认知功能损害,而lw-afc具有改善阿尔茨海默症小鼠出现的认知功能障碍的功能。基于16s测序,平均每个样本得到160,684条原始序列。在这些样本中,一共检测到13,727个otu。小鼠肠道菌群的比较表明,用药组SAMP8小鼠的肠道菌群结构与对照组SAMR1小鼠的更类似。在属分类水平,与对照组SAMR1小鼠相比,疾病组SAMP8小鼠的肠道微生物组中有8个丰度显著上调的OTU和12个丰度下调的OTU。而与未用药的疾病组SAMP8小鼠相比,用药组SAMP8小鼠其肠道菌群也有20个具有丰度差异的OTU,其中15个丰度增加,5个丰度下降。在所有的差异OTU中,有13个OTU的丰度被LW-AFC反向调节,即疾病组SAMP8小鼠相对于SAMR1小鼠丰度增加或降低的OTU,其丰度在用药组小鼠中分别反向降低或增加。此外,相关性分析表明,在属水平,共计有18个属与小鼠的至少一种认知能力有关,其中有7个属与所有3种认知能力显著相关,并且值得注意的是,这7个属的丰度均被LW-AFC反向调节。结果表明,疾病组SAMP8小鼠相对于对照组小鼠而言其肠道菌群出现了显著变化,而且LW-AFC可能具有修复这种菌群失调的能力。总的来说,本文基于宏基因组测序技术刻画了相应疾病状态下胆道和肠道微生物组的构成和功能,为进一步研究微生物组在疾病发病中的作用奠定了基础。主要有以下创新点:本论文首次系统获得胆总管胆汁菌群构成情况,一次就发现了前人没有报道过的13种胆道细菌,并发现了菌群结构存在两种主要的分型,同时鉴别出菌群功能基因,重构菌群代谢通路网络,这些研究都是前人未曾做过的;首次通过对6位胆总管结石患者的胆总管胆汁与其他三个上消化道位点的比较,为医学界一直争论的胆道细菌的来源提供了证据,同时初步揭示了胆道环境对菌群的影响;此外,对阿尔茨海默症小鼠的肠道菌群的研究表明,疾病组小鼠相对于对照小鼠出现了菌群失调,而且LW-AFC可能具有修复这种菌群失调的能力,为寻找潜在的药物靶点提供了线索。结果表明宏基因组测序技术在微生物组研究中和临床诊疗中具有广阔的应用前景。
【关键词】：胆道 肠道 微生物组 宏基因组测序
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.7;R749.16
【目录】：

• 缩略语一览表4-5
• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-19
• 第一部分 胆总管结石患者胆总管胆汁的宏基因组学研究19-50
• 1.1 研究背景19-21
• 1.2 材料和方法21-36
• 1.3 结果36-47
• 1.4 讨论47-49
• 1.5 小结49-50
• 第二部分 胆总管结石患者胆道和上消化道微生物组的比较研究50-68
• 2.1 研究背景50-51
• 2.2 材料和方法51-57
• 2.3 结果57-65
• 2.4 讨论65-67
• 2.5 小结67-68
• 第三部分 中药LW-AFC对阿尔茨海默症小鼠肠道菌群的效应研究68-89
• 3.1 研究背景68-69
• 3.2 材料和方法69-76
• 3.3 结果76-85
• 3.4 讨论85-87
• 3.5 小结87-89
• 讨论与展望89-92
• 总结92-94
• 参考文献94-113
• 附录113-127
• 个人简历127-129
• 致谢129

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本文编号：1038421