骨髓间充质干细胞移植对大鼠重症急性胰腺炎时自噬变化的影响及机制探讨

发布时间：2017-10-19 04:21

  本文关键词：骨髓间充质干细胞移植对大鼠重症急性胰腺炎时自噬变化的影响及机制探讨

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【摘要】：目的:建立大鼠重症急性胰腺炎模型。观察急性胰腺炎发生过程中自噬活性的变化,探讨其病理意义。观察同种异体骨髓间充质干细胞移植对重症急性胰腺炎自噬的影响,阐明MSCs治疗重症急性胰腺炎的分子机制。方法:将健康体重250±50克,5-6周龄的雌性SD大鼠随机分为正常对照组,SAP模型组,SAP+MSCs移植组。每只大鼠尾静脉注射自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)2×109,在室温22-28℃,相对湿度40-70%的动物房内适应性喂养一周后开始造模,造模前12h起禁食不禁水。采用腹腔注射20%L-精氨酸的方法建立SAP大鼠模型,正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射。造模前一周取雄性健康SD大鼠做MSCs培养,将培养好的同种异体SD大鼠第三代MSCs作为种子细胞,在SAP+MSCs移植组大鼠腹腔注射第一次精氨酸后即开始尾静脉注射,注射量为5×106个/只,SAP模型组及正常对照组均予尾静脉注射同体积0.9%NaCl溶液,所有大鼠均禁食不禁水。分别在开始造模6h、12h、24h、48h、72h,分别在三组动物中抽取静脉血,分离制作血清,-200C保存,检测不同时间点血淀粉酶、IL-6、TNF-α、以及胰蛋白酶原激活肽的含量。分别在以上5个时间点每组分别处死5只动物,打开腹腔,观察胰腺周围有无水肿及渗出。按上述固定的各时间点取胰腺、肺、肾组织标本,石蜡包埋,切片,HE染色,采用盲法在光镜下读片,进行胰腺组织病理学评分;同时做石蜡切片在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成,免疫印迹法检测大鼠胰腺组织LCⅡ,以及12h大鼠胰腺组织PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白表达,用Image J软件分析蛋白条带进行灰度值计算,得到目的蛋白的相对含量。全部数据使用SPSS18.0统计软件进行分析,计量资料以?x±s表示,两样本均数比较采取t检验,P0.05为差异有统计学意义。结果与正常对照组相比,SAP组胰腺组织充血水肿,炎症细胞浸润,部分胰腺结构模糊甚至消失;胰腺组织病理学评分增加,血清淀粉酶、胰蛋白酶原激活肽、TNF-α和IL-6水平均升高(P0.05)。荧光显微镜下观察SAP组大鼠胰腺组织自噬相关超微结构明显增多,免疫印迹法显示与对照组相比,6h、12hSAP组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达显著增多(p0.05);与模型组相比,移植组胰腺组织病理学评分下降,血清淀粉酶、胰蛋白酶原激活肽、TNF-α和IL-6水平均降低(P0.05),免疫印迹法显示与SAP组相比,移植组大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ有所减少(p0.05);24h、48h、72h三组相比无统计学意义(P〉0.05)。12h胰腺组织PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白的表达显示,3组PI3K、mTOR蛋白表达无显著性差异(P〉0.05),与对照组相比,模型组p-PI3K、p-mTOR蛋白表达明显增加(p0.05);与模型组相比,移植组p-PI3K、p-mTOR蛋白表达明显降低(P0.05)。结论重症急性胰腺炎可诱导增强自噬的发生,自噬促进胰蛋白酶原的激活,并参与胰腺的损伤;骨髓间充质干细胞有可能通过PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制自噬的发生,从而减轻胰腺炎以及胰腺炎相关的多脏器损伤。
【关键词】：重症急性胰腺炎 骨髓间充质干细胞自噬 PI3K-AKT-mTOR 信号通路
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-15
• 参考文献13-15
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的培养及鉴定15-24
• 一、骨髓间充质干细胞的原代及传代培养15
• 二、材料和方法15-19
• 三、结果19-20
• 四、讨论20-23
• 参考文献23-24
• 第二部分 重症急性胰腺炎大鼠模型的建立24-38
• 一、材料和方法24-29
• 二、结果29-32
• 三、讨论32-36
• 参考文献36-38
• 第三部分 自噬在急性胰腺炎中的变化及其意义38-52
• 一、材料与方法39-43
• 二、结果43-45
• 三、讨论45-50
• 参考文献50-52
• 第四部分 骨髓间充质干细胞在急性重症胰腺炎时对胰腺腺泡细胞自噬的影响及机制探讨52-67
• 一、材料和方法53-58
• 二、结果58-60
• 三、讨论60-64
• 参考文献64-67
• 全文结论67-68
• 综述 自噬与急性胰腺炎68-74
• 参考文献72-74
• 缩略词表74-75
• 攻读学位期间公开发表论文75-76
• 致谢76-77

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本文编号：1059010