慢性乙型、丙型肝炎患者血清糖蛋白糖链谱的研究

发布时间：2017-10-21 06:02

  本文关键词：慢性乙型、丙型肝炎患者血清糖蛋白糖链谱的研究

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【摘要】：研究背景及意义：慢性乙型、丙型肝炎是关乎全世界范围内的公共卫生安全的传染性疾病。慢性肝炎是由肝炎病毒感染肝脏引起的,导致肝组织损伤和炎症疾病。病毒感染机体6个月后,55%85%急性感染者将转变为慢性肝炎,15%～30%慢性肝炎患者在20～25年后会发展为肝硬化和肝细胞癌。研究表明在肝脏的炎症、纤维化、癌变的过程中,患者血清出现糖蛋白糖链结构和功能的改变,这种变化与肝病的发生发展密切相关。慢性肝炎发生发展过程中常伴随有缓慢的肝纤维化进程。本实验的研究对象是肝纤维化分级为F0-F1时期的慢性肝炎患者,筛选慢性乙型、丙型肝炎患者血清特异性变化的糖蛋白糖链,具有十分重要的意义。首先,为肝炎的血清学诊断标志物提供新的理论依据,寻找肝纤维化早期诊断标志物和治疗靶标提供理论支撑；其次,为病毒性肝炎的治疗提供新的方向,筛选血清中变化的糖链后,可进一步确定病毒侵染肝细胞后肝细胞中相关糖酶的变化。通过某种高表达的糖基转移酶和糖苷酶来抑制病毒蛋白的表达,从而起到独特地抑制病毒复制的效果；最后,清楚的了解病毒感染肝脏导致血清糖蛋白糖链特异的变化可为研究HBV、HCV慢性感染引发的癌症机制研究提供新的线索。方法：本研究利用凝集素芯片技术检测45例健康志愿者(对照组)、54例慢性乙型肝炎和57例慢性丙型肝炎(实验组)患者血清糖蛋白糖链谱。筛选两种肝炎病毒感染肝脏导致患者血清糖蛋白糖链的表达差异,选择慢性乙肝和慢性丙型肝炎患者血清中凝集素识别的特异性变化的糖链,利用凝集素印迹技术进行进一步验证并推测差异性表达糖链及其分子机制。选取慢性乙肝、丙肝患者血清中表达差异最显著的糖链所对应的凝集素,制备凝集素磁性微粒复合物,然后利用该复合物富集分离血清中凝集素识别的特异性糖蛋白,PNGase F酶解N-糖链,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)对血清中N-连接糖蛋白糖链进行鉴定和解析,结合凝集素芯片的结果推测得到慢性乙肝、丙肝患者血清中变化的完整糖链结构。结果：1.应用凝集素芯片技术筛选慢性乙肝、丙型肝炎患者血清相对于健康志愿者血清中差异性表达的糖蛋白糖链,结果表明慢性乙肝中共15种凝集素(HHL、GSL-Ⅱ、EEL、LEL、GSL-Ⅰ、DBA、LCA、PTL-ⅠI、SBA、VVA、NPA、PSA、UEA-Ⅰ、ACA和PHE-E+L)识别的糖链发生变化,慢性丙肝中共7种凝集素(SBA、LEL、MAL-Ⅰ、VVA、WGA、DBA和PHA-E+L)识别的糖链结构发生变化。共同变化的有5种凝集素(LEL、SBA、MAL-Ⅰ、VVA和PHA-E+L)识别的糖链发生变化。2.比较特殊的是,PHA-E+L识别的bi-antennary、bisecting GlcNAc tri- and tetra-antennary complex-type N-glycan糖链结构在混合和个例样本中均表现一致的变化,即在慢性乙肝中低表达,慢性丙肝中高表达。研究表明GnT-Ⅲ参与编码的平分型N-糖链与肝脏疾病密切相关,该糖链可被PHA-E+L识别。因此,选择凝集素PHA-E+L富集健康志愿者、慢性乙肝和慢性丙肝患者血清中糖蛋白,经过SDS-PAGE电泳结果鉴定,以及第二章凝集素印迹(PHA-E+L)的结果可以看出,差异性糖蛋白主要表现在分子量在250kDa处的蛋白条带和55kDa处的蛋白条带。用MALDI-TOF/TOF质谱仪对血清中富集到的N-连接糖蛋白糖链进行鉴定。3.质谱结果,①健康志愿者、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者血清中分别共鉴定到18种、23种,26种糖链峰。与健康志愿者相比,慢性乙肝患者中发生变化的糖链峰有m/z为1850.666、1866.465、2037.750、2151.793、2304.835这五种糖链峰对应的糖链结构。此外,在慢性丙肝患者中除了这五种糖链峰对应的糖链外,糖链峰还有m/z为1460.502、2069.740、2174.772三种糖链峰对应的完整糖链结构。②慢性丙肝患者血清中PHA-E+L富集到的N-糖链种类最多,平分型N-糖链占绝大多数。并且糖链末端多为半乳糖和N-L酰半乳糖。③慢性乙肝和慢性丙肝患者中,富集到的N-糖链多为二天线(包括平分型)和三天线型,仅出现了一个四天线型的复杂N-糖链。4.综合凝集素芯片和质谱结果分析表明,病毒感染肝脏引起血清糖蛋白糖链变化异常明显,慢性乙肝患者血清中主要是末端Gal糖基化减少,随之增多是末端GalNAc和GlcNAc糖基化结构。慢性丙肝患者血清中,唾液酸化结构、岩藻糖基化以及分支结构的糖链明显增加。
【关键词】：乙型/丙型肝炎 凝集素芯片 糖蛋白 糖链 质谱
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.6
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文缩略表9-13
• 第一章 文献综述13-26
• 1.1 糖蛋白研究概述13-18
• 1.1.1 糖蛋白定义及其功能13
• 1.1.2 糖蛋白糖链类型及合成13-15
• 1.1.3 糖蛋白富集与分离15-16
• 1.1.4 糖蛋白糖链的结构解析16-18
• 1.2 乙型及丙型肝炎概述18-22
• 1.2.1 乙型及丙型肝炎发现及特点18-19
• 1.2.2 乙型、丙型肝炎病毒致病性19-20
• 1.2.3 慢性乙型、丙型肝炎发展自然史20-21
• 1.2.4 肝炎与糖基化变化21-22
• 1.3 肝纤维化的研究进展22-25
• 1.3.1 肝纤维化及诊断方法22-23
• 1.3.2 肝纤维化糖链标志物23-24
• 1.3.3 肝纤维化分子机制与异常糖基化24-25
• 1.4 本课题研究目的与意义25-26
• 第二章 慢性肝炎患者血清糖蛋白糖链谱变化的研究26-45
• 2.1 引言26-27
• 2.2 实验材料与仪器27-29
• 2.2.1 实验试剂与耗材27
• 2.2.2 实验主要仪器27-28
• 2.2.3 实验相关试剂配制28-29
• 2.3 实验方法29-35
• 2.3.1 研究人群和血清收集29
• 2.3.2 血清总蛋白Bradford定量29-30
• 2.3.3 血清总蛋白Cy3荧光标记与纯化30
• 2.3.4 凝集素芯片检测血清样本30-32
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳32-34
• 2.3.6 凝集素印迹34-35
• 2.4 实验结果35-43
• 2.4.1 血清蛋白的Bradford定量结果35-36
• 2.4.2 凝集素芯片梯度实验36-37
• 2.4.3 慢性乙肝、丙肝和健康志愿者混合样本血清糖蛋白糖链谱37
• 2.4.4 慢性乙肝、丙肝和健康志愿者混合样本血清糖蛋白糖链谱的变化37-39
• 2.4.5 个例样本验证血清糖蛋白糖链谱的变化39-41
• 2.4.6 凝集素印迹验证差异表达糖链41-43
• 2.5 讨论43
• 2.6 本章小结43-45
• 第三章 PHA-E+L富集肝炎患者血清糖蛋白N-糖链谱分析45-59
• 3.1 引言45
• 3.2 实验材料与仪器45-47
• 3.2.1 实验试剂与耗材45-46
• 3.2.2 实验主要仪器46
• 3.2.3 实验相关试剂配制46-47
• 3.3 实验方法47-50
• 3.3.1 凝集素PHA-E+L磁性微粒富集糖蛋白47-48
• 3.3.2 纯化糖蛋白的SDS-PAGE鉴定48
• 3.3.3 糖链的释放48
• 3.3.4 糖链的纯化48-49
• 3.3.5 糖链的质谱解析49-50
• 3.4 实验结果50-57
• 3.4.0 PHA-E+L磁性微粒的偶联量的计算50
• 3.4.1 PHA-E+L富集的糖蛋白SDS-PAGE电泳鉴定50-51
• 3.4.2 PHA-E+L识别的 N-糖链一级质谱全貌图51-52
• 3.4.3 PHA-E+L识别的 N-糖链一级质谱糖链注释图52-56
• 3.4.4 PHA-E+L识别的 N-糖链串联质谱分析图56-57
• 3.5 讨论57
• 3.6 小结57-59
• 全文总结59-61
• 参考文献61-68
• 致谢68-69
• 攻读硕士学位期间取得的科研成果69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨刚龙;马恬然;李铮;;基于超滤膜辅助的糖蛋白全N-连接糖链的富集和质谱解析(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2014年04期

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本文编号：1071657