间歇低氧对肝脏损伤机制及自噬在肝脏中作用机制的探讨

发布时间：2017-10-24 19:24

  本文关键词：间歇低氧对肝脏损伤机制及自噬在肝脏中作用机制的探讨

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【摘要】：目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(Obstructive sleep apnea,OSA)是常见的呼吸系统疾病,据统计有超过10%的人群罹患此病。OSA对于身体的严重危害及致死率增加,主要是因为OSA常合并糖尿病,代谢综合征,心血管系统疾病等。目前很多证据显示,由于OSA患者发生了气体交换障碍(反复低血氧和高碳酸血症)的病生理改变,即慢性间歇低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),导致前炎症因子产物增多,血管内皮功能紊乱,氧化应激,代谢调节异常和胰岛素抵抗等。因为肝脏在人体是十分重要的代谢器官,肝细胞对各种内源性和外源性刺激如病毒感染、炎症、营养等非常敏感,现有很多报道OSA与肝脏的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)有关。本研究旨在通过间歇低氧动物模型探讨间歇低氧引起的肝脏损害,对肝脏药物代谢酶细胞色素酶P450(Cytochrome P450,CYPs)的影响及作用机制,从自噬角度对间歇低氧的作用做了进一步探讨。我们的实验证实糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)对大鼠肝脏细胞色素酶P450(Cyps)的表达有重要的调控作用,并且对自噬有一定影响,所以我们又通过人的正常肝细胞LO2细胞初步探讨糖皮质激素在人肝脏细胞CYPs代谢的影响及自噬中的作用。方法:1.建立间歇低氧(intermittent hypoxia,IH)大鼠模型,将30只大鼠采用随机数字表法随机分为2组(按照每组15只分组):IH组和对照组。2.大鼠肝脏组织进行固定、包埋、病理切片,然后进行苏木素-伊红(HE)染色,观察肝组织形态学改变。3.通过实时定量PCR方法测定炎症因子、Cyps、NF-κB、核受体的相对基因表达量。4.使用实时定量PCR法分析肝脏自噬相关蛋白的基因表达。5.将人正常肝细胞LO2肝细胞进行常规培养,然后传代,将传代细胞按顺序分别接种于6孔板,根据加入药物不同,分为对照组,糖皮质激素(地塞米松,DEX)组和糖皮质激素+糖皮质激素受体拮抗剂(DEX+R)组;对照组:正常细胞培养;DEX组:加入地塞米松进行培养;DEX+R组:在DEX组基础上加用糖皮质激素受体拮抗剂。6.通过倒置显微镜观察人肝细胞LO2细胞形态的改变及生长情况变化并进行拍照。7.通过实时定量PCR方法测定肝细胞LO2细胞Cyps的相对基因表达量。8.使用实时定量PCR法分析测定肝细胞LO2细胞自噬相关蛋白的基因表达。结果:1.对照组和间歇低氧组大鼠肝组织病理形态学改变:对照组:肝小叶结构完整,窦状隙及汇管区未见明显增宽及结构紊乱,肝细胞胞膜完整,胞质丰富,胞核形态正常,与正常肝组织无差异;间歇低氧组:肝小叶结构完整,窦状隙呈轻度增宽,肝细胞结构完整,汇管区可见少许炎细胞浸润,以淋巴细胞为主,少许肝细胞胞质稀疏。2.肝组织炎症介质m RNA相对表达量的改变:IH组IL-1β、IL-6、TNFαm RNA相对表达量较对照组升高。3.肝组织NF-κB m RNA相对表达量的改变:IH组NF-κB m RNA相对表达量较对照组显著升高。4.核受体m RNA相对表达量的改变:IH组PXR、GR、CAR m RNA相对表达量较对照组下调。5.细胞色素氧化酶P450(Cyps)m RNA相对表达量的改变:IH组Cyp1A2、Cyp2D4、Cyp3A2 m RNA相对表达量较对照组下降有统计学差异;Cyp2C9、Cyp2C19 m RNA相对表达量与对照组相比无明显差异。6.细胞自噬相关基因(Atg)相对表达量的改变:IH组与对照组相比,AMPK,m TOR,Beclin1,Atg5,Atg12,Atg13,ULK1均有相应改变但无统计学意义,LC3与WIPI的变化有统计学意义。7.肝LO2细胞生长情况:地塞米松组LO2细胞生长变形,呈梭形生长,而加入糖皮质激素受体拮抗剂组,LO2细胞生长与对照组相同,为正常细胞形态。8.肝LO2细胞Cyps表达:通过荧光实时定量PCR详细阐述了各组人细胞色素酶P450(h CYP450)中h CYP1A2、h CYP2C9、h CYP2C19、h CYP2D6、h CYP3A4m RNA在人肝脏LO2细胞中的相对表达量。与对照组相比,Dex组人肝脏LO2细胞的h CYP1A2、h CYP2C19、h CYP3A4 m RNA表达量上调,相应的,Dex+R组人肝脏LO2细胞的上述基因表达下调,且有统计学差异(p0.05);而Dex组人肝脏LO2细胞的h CYP2C9基因表达量较对照组为下降趋势,h CYP2D6基因表达量较对照组无显著变化9.肝LO2细胞自噬相关基因的表达:通过荧光实时定量PCR详细阐述了各组细胞的自噬相关基因的相对表达量。测定结果发现,与对照组相比,除Dex组人肝脏LO2细胞的Beclin1 m RNA表达量下调(p0.05)外,余细胞自噬相关的基因及参与自噬过程的自噬相关蛋白的基因表达量较对照组均无显著变化。结论:1.间歇低氧可以引起肝脏结构改变,促进炎性因子释放,并通过NF-κB-核受体通路来影响细胞色素酶Cyps的表达;2.间歇低氧可以通过糖皮质激素受体通路诱导肝脏自噬,保护肝脏避免凋亡发生;3.糖皮质激素可以影响肝细胞生长,并使细胞色素Cyps表达受影响;但是从实验数据来看,对肝细胞自噬发生没有诱导作用。
【关键词】：间歇低氧 炎症因子 CYP 自噬 LO2细胞 核受体
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R766;R575
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-18
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 技术路线16-18
• 一、间歇低氧对大鼠肝脏损害及药物代谢酶影响18-39
• 1.1 材料和方法18-25
• 1.1.1 实验动物18
• 1.1.2 实验设备和材料18-21
• 1.1.3 实验方法21-25
• 1.1.4 统计分析25
• 1.2 结果25-29
• 1.2.1 实验大鼠肝组织病理学形态观察25-26
• 1.2.2 肝组织炎症介质mRNA定量PCR结果26-27
• 1.2.3 肝组织Cyp450 mRNA相对表达量结果27-28
• 1.2.4 肝组织中NF-κB mRNA相对表达量结果28
• 1.2.5 肝组织中核受体mRNA相对表达量结果28-29
• 1.3 讨论29-38
• 1.3.1 阻塞性睡眠呼吸暂停与器官损害：29-32
• 1.3.2 间歇低氧引起肝脏的损害：32-34
• 1.3.3 NF-κB-核受体通路在肝脏中的作用34-38
• 1.4 小结38-39
• 二、间歇低氧对大鼠肝脏自噬的影响39-56
• 2.1 材料和方法39-42
• 2.1.1 实验动物39
• 2.1.2 实验动物分组39-40
• 2.1.3 间歇低氧大鼠模型建立40
• 2.1.4 总RNA提取及实时定量PCR40-42
• 2.1.5 统计分析42
• 2.2 结果42-43
• 2.3 讨论43-55
• 2.3.1 自噬的发生及信号转导43-49
• 2.3.2 自噬相关蛋白在自噬中的作用49-52
• 2.3.3 间歇低氧与细胞自噬52-55
• 2.4 小结55-56
• 三、糖皮质激素在肝细胞自噬中的作用56-73
• 3.1 材料和方法56-63
• 3.1.1 实验材料56
• 3.1.2 实验试剂及材料56-57
• 3.1.3 主要实验仪器及耗材57-58
• 3.1.4 细胞培养及处理58-59
• 3.1.5 人肝脏LO2细胞总RNA提取及Qrt-PCR59-62
• 3.1.6 统计分析62-63
• 3.2 实验结果63-65
• 3.2.1 肝正常细胞LO2细胞形态及生长情况63-64
• 3.2.2 人肝脏LO2细胞细胞色素氧化酶P450的表达64
• 3.2.3 人肝脏LO2细胞自噬相关基因表达结果64-65
• 3.3 讨论65-73
• 3.3.1 自噬在肝脏中的作用65-67
• 3.3.2 自噬介导的肝脏代谢67-70
• 3.3.3 糖皮质激素在自噬中的作用70-73
• 全文结论73-74
• 论文创新点74-75
• 参考文献75-84
• 发表论文和参加科研情况说明84-85
• 附录85-86
• 综述86-106
• 综述参考文献95-106
• 致谢106-108
• 个人简历108

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