c-Met抑制剂联合塞来昔布作用于肝胆管结石并胆管癌的实验研究

发布时间：2017-10-24 20:16

  本文关键词：c-Met抑制剂联合塞来昔布作用于肝胆管结石并胆管癌的实验研究

  更多相关文章： 肝胆管结石 胆管癌 c-Met COX-2 凋亡

【摘要】：背景肝胆管结石常指发生于左、右肝胆管及其分支内的结石,常合并肝外胆管结石、肝内外胆管狭窄和肝脏的纤维化改变。文献中关于肝胆管结石的记载始于16世纪左右。肝胆管结石多见于亚洲,中国大陆此病发病率较高。肝内胆管结石合并感染反复发作是导致肝内胆管癌发生的常见因素。肝内胆管癌(ICC)是一种发病率较高的恶性肿瘤疾病,发病年龄多为50-70岁。胆管癌的病因目前尚不清楚,有研究表明,常年患有肝胆管结石的病例是胆管癌的高发人群,肝胆管结石患者2%-10%的病例有发生胆管癌的风险,一般认为是肝胆管结石对胆管壁的长期机械刺激及其所引起的慢性胆道感染和胆汁淤积等因素可导致胆管壁的慢性增生性炎症、受累区域的肝胆管扩张、胆管呈环状或节段性狭窄；受累胆管壁可增厚、胆管壁及周围纤维组织增生并慢性炎症细胞浸润；汇管区大量炎性细胞浸润和纤维细胞增生,伴有肝实质损害,严重者形成肝段或肝叶的纤维化萎缩和肝功能损害。而胆管壁炎性增厚,纤维化和狭窄,继而引起胆管黏膜上皮的不典型增生。病理学观察发现,胆管黏膜上皮的不典型增生可逐渐移行成腺癌。然而,当出现肝胆管结石合并胆管癌时,由于在临床表现上患者多与单纯性肝胆管结石并发胆管炎相类似,而无特异性,同时在临床检查时往往由于结石与肿瘤的并存,容易掩盖肿瘤的存在造成漏诊而错过了最佳治疗时机,因此,积极开展对肝胆管结石并胆管癌的基础与临床治疗研究有重要的现实意义。很多基础、临床和流行病学的研究已经证实,炎症是一个明确可以导致肿瘤的危险因素。炎症与肿瘤的关系最早引起研究者的关注,是因为人们在肿瘤的标本中发现了免疫细胞浸润。当时这个现象大多被解释成为机体免疫系统对肿瘤细胞的应答,但是后来有研究认为“肿瘤起源于慢性炎症”。此外,在肿瘤中发现的免疫细胞类型与非肿瘤性炎症部位的细胞类型一致。此后越来越多的科学家深入研究肿瘤与炎症的关系,发现慢性炎症是许多恶性肿瘤发生的高危因素,参与恶变、肿瘤形成、发展、侵袭、转移等多个过程,被列为肿瘤细胞十大生物学特征之一。炎症,特别是慢性炎症,是导致肿瘤发生和进展的重要因素之一,而这类疾病有学者称之为是“炎症相关性肿瘤”。导致各种炎症相关性肿瘤的病原明显是不相关的,然而它们之间在病理特征上关键的共同特点是可以持续介导炎症：最初是由激活的巨噬细胞、淋巴细胞的浸润,然后是被由纤维细胞和血管生成相关细胞组成的间质激活。同时认为这些浸润的炎症细胞持续产生的ROS和NO可能会损伤正常细胞。这可能会反过来导致代偿性的细胞增殖,之后导致DNA损伤、基因突变的积累,并有效地把内源性及外源性肿瘤因子带入正常生长的细胞当中。除此之外,近期也发现炎症环境可以加速表观遗传学的改变,这些改变可能导致炎症相关肿瘤的发生。c-Met是一种由c-Met原癌基因编码的蛋白产物,为肝细胞生长因子(HGF)的受体,具有酪氨酸激酶活性,与多种癌基因产物和调节蛋白相关,参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控,是细胞增殖、分化和运动的重要因素。肝细胞生长因子(HGF)是c-Met受体的配体,主要由间充质细胞产生,以自分泌和旁分泌的方式起效,属于典型的间质细胞来源的生长因子；HGF能刺激多种细胞生长,并参与血管生成及免疫活性的调节,还可促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭,是一种具有多种功能的生物因子。当c-Met与其配体HGF结合后,胞质中酪氨酸残基(Tyr1234、Tyr1235)可发生自身磷酸化,从而激活c-Met胞质内蛋白激酶结构域中酪氨酸激酶,激活的PTK可引起c-Met羧基末端酪氨酸的自身磷酸化。随后,细胞质中的多种效应蛋白募集到磷酸化的羧基末端并被快速磷酸化,最后激活细胞内多种信号通路。研究发现,c-Met通路异常会诱发肿瘤的发生和转移；c-Met与肿瘤对多种激酶抑制剂的耐药性相关；c-Met可与多种膜受体之间的相互作用促进了肿瘤的发生和转移,诱导产生耐药性。在肿瘤细胞中有许多分子机制可以激活c-Met,最常见的方式是通过HGF和c-Met结合发挥作用。HGF和c-Met结合导致受体自身磷酸化,增强了c-Met酪氨酸激酶的活性,导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化。以c-Met为作用靶点的药物酪氨酸激酶抑制剂已经逐步进入了临床试验阶段,而PF-2341066是在2011年获得美国FDA受理进入优先评审程序的一种c-Met抑制剂。人类COX-2基因定位于1号染色体的1q25.2-q25.3,全长8.3 kb,由10个外显子和9个内含子构成,编码604个氨基酸残基组成的多肽。COX-2与COX-1具有61%的同源性,但却表现出明显的功能差异。COX-2主要分布于细胞核膜上,其表达调控主要集中在转录水平。诱导其表达的因素包括癌基因、白细胞介素-1、缺氧、紫外线、转化生长因子和肿瘤坏死因子-α等,而地塞米松、抗氧化剂、抑癌蛋白P53则可抑制其表达。COX-2的致癌机制,现在比较认同的观点是认为COX-2可通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管形成、抑制免疫功能等机制,参与肿瘤的发生和发展。其中主要是促进细胞增殖和抑制凋亡、促进血管形成。塞来昔布(Celecoxib)是第一个上市的COX-2选择性抑制剂。美国佛雷德里克的国家癌症研究所的Xu等研究人员发现COX-2的抑制剂塞来昔布具有抗血管生成的效用。美国Emory大学研究者的一项研究显示,塞来昔布可能通过激活外源性死亡受体通路引起非小细胞肺癌肿瘤细胞的凋亡。研究人员利用小鼠模型,通过塞来昔布抑制COX-2的表达,结果发现,VEGF通路的抑制被明显增强了,最终得以有效抑制肿瘤生成及转移、延长了生存期。随着对肿瘤生物行为的不断深入研究,发现血管生成对肿瘤的生长、发展起着至关重要的作用。肿瘤血管生成由正负两方面调节,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是重要的促血管生长因素。肿瘤发展的过程可分为无血管和有血管两个阶段,对于无血管阶段,肿瘤细胞主要依靠弥散活动,由邻近的血供系统获得氧气和营养物质,并运走代谢产物,此时肿瘤细胞的凋亡率很高,体积很少超过1～2mm3,肿瘤呈休眠状态,这一过程可持续数周或数年。而一旦肿瘤细胞发生具有抗凋亡活性表型的突变,即转入有血管阶段。进入有血管阶段后,瘤体快速增大并可能发生转移。血管内皮生长因子特异性地作用于血管内皮细胞,参与肿瘤血管的新生,为血管内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质。当肿瘤组织直径1cm以后,被激活的肿瘤组织通过自分泌或旁分泌机制合成和分泌VEGF,促进肿瘤周围组织建立起丰富的毛细血管网,在VEGF等血管生成因子的作用下,血管内皮细胞分泌胶原酶和纤溶酶原借以降解血管基底膜,同时,肿瘤组织内部新形成的微血管基膜不完善,这使得肿瘤细胞并不需要很复杂的侵袭过程就能直接进入到血道中,有利于肿瘤细胞在新的部位生长及增殖。有研究表明,c-Met可作用于COX-2。Jones等对大鼠胃上皮细胞的研究认为,HGF通过c-Met磷酸化和ERK-2细胞信号转导途径来激活COX-2基因的表达。c-Met基因表达阳性的胃癌组织中微血管密度均值显著高于阴性组,说明c-Met基因表达阳性的胃癌细胞更易生成肿瘤微血管,可能机制是上调COX-2表达和增加前列腺素合成,从而影响胃癌的生长和转移。目的探讨COX-2和C-Met在肝胆管结石合并胆管癌组织中,二者的组织表达情况；观察PF-2341066及塞来昔布联合作用于胆管癌细胞株QBC939及胆管癌裸鼠荷瘤模型的实验效果；探讨HGF—c-Met—COX-2—PGE2—VEGF是否为促进胆管癌血管生成的一个潜在信号通路：探讨c-Met抑制剂PF-2341066及COX-2抑制剂塞来昔布的联合使用能否为该类肿瘤未来的治疗策略提供一种新的靶点治疗方案。方法1.Western blot法、RT-PCR检测胆管癌组织中c-Met、COX-2的表达,分析其与该疾病临床病理征之间的关系。2. c-Met和COX-2的表达水平与患者临床病理参数及预后关系的分析方法：c-Met和COX-2的表达水平与肝胆管结石并胆管癌患者临床病理参数之间的关系采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis法检验分析；二者与患者预后关系采用Cox比例风险回归分析模型(Cox proportional hazards model)进行分析。3.MTT法检测细胞生长：体外培养胆管癌QBC939细胞株,然后用c-Met抑制剂PF-2341066联合塞来昔布进行干预,检测细胞增殖情况。4.流式细胞术检测细胞凋亡：体外培养胆管癌QBC939细胞株,然后用c-Met抑制剂PF-2341066联合塞来昔布进行干预,采用Annexin V-EGFP和Propidium Iodide染色,染色后采用流式细胞仪进行分析,检测细胞凋亡情况。5.构建裸鼠荷瘤模型,采用PF-2341066联合塞来昔布对其进行干预,MTT法和流式细胞术分别检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况。结果1. c-Met、COX-2在肝胆管结石并胆管癌组织中的蛋白表达均为最高,其在癌旁组织中的表达又比在肝胆管结石胆管组织及正常组织中高,组间有显著的统计学差异(P0.05)。2.肝胆管结石并胆管癌组织内c-Met和COX-2表达水平明显与胆管癌的肿瘤分期有关,肿瘤分期为Ⅲ和Ⅳ期的胆管癌组织内c-Met和COX-2表达明显高于分期为Ⅰ和Ⅱ期的胆管癌组织(P0.05); c-Met和COX-2表达与淋巴结转移也有显著的相关性,淋巴结转移阳性患者的胆管癌组织内c-Met和COX-2水平明显高于淋巴结转移阴性的胆管癌组织(P0.05)；此外已经出现远处转移病灶患者的胆管癌组织中c-Met和COX-2表达水平也明显高于没有远处转移灶的胆管癌组织(P0.05)；由此可见,c-Met和COX-2在胆管癌的临床进展和远处转移中可能发挥了重要作用。3.采用Cox多因素回归分析胆管癌患者的预后相关因素。结果发现,癌组织中c-Met和COX-2表达高的患者预后更差,提示c-Met、COX-2的表达与患者预后呈负相关,c-Met与COX-2可能是胆管癌预后的危险因素(P0.05)。此外统计分析提示,肿瘤的分期(P0.05)、淋巴结转移情况(P0.05)和远处是否存在转移灶(P0.05)同样是胆管癌患者预后的危险因素。4.使用胆管癌细胞株QBC939进行体外实验,采用不同浓度的c-Met抑制剂作用QBC939细胞后,检测其增殖与凋亡的变化,结果显示QBC939细胞的增殖抑制率随c-Met抑制剂浓度增高而增高,并且发现在PF-2341066和塞来昔布联合用药组中的细胞增殖抑制率最高,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)。同样方法处理细胞后,使用流式细胞仪对QBC939细胞的凋亡进行检测,结果显示,QBC939的细胞凋亡率随c-Met抑制剂浓度增高而增高,并且发现在PF-2341066和塞来昔布联合用药组中的细胞凋亡率最高,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)5.采用不同浓度的c-Met抑制剂作用QBC939细胞株后,对细胞的c-Met、 COX-2、VEGF蛋白与mRNA表达水平进行检测,可以发现c-Met、COX-2、VEGF蛋白与mRNA表达水平随c-Met抑制剂的浓度增加而降低,并在PF-2341066和塞来昔布联合用药组中的表达最低,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)。6.构建裸鼠荷瘤模型,采用c-Met抑制剂联合塞来昔布干预荷瘤裸鼠后,对肿瘤体积大小进行比较,发现肿瘤体积随c-Met抑制剂浓度增加而减小PF-2341066和塞来昔布联合用药组的肿瘤平均体积最小,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)7.采用不同浓度的c-Met抑制剂对荷瘤裸鼠进行干预作用后,检测其肿瘤细胞增殖与凋亡的变化。结果显示,肿瘤细胞的增殖抑制率随c-Met抑制剂浓度增高而增高,并且在PF-2341066和塞来昔布联合用药组的增殖抑制率最高,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)。同样方法处理细胞后,使用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测,结果显示,细胞凋亡率随c-Met抑制剂浓度增高而增高,并且在联合用药组的凋亡率最高,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)。8.采用不同浓度的c-Met抑制剂对荷瘤裸鼠进行干预作用后,对肿瘤组织的c-Me、COX-2、VEGF蛋白与mRNA表达水平进行检测,可以发现c-Met、 COX-2、VEGF蛋白与mRNA表达水平随c-Met抑制剂浓度的增加而降低,并在PF-2341066和塞来昔布联合用药组的表达最低,与对照组比较有显著的统计学差异(P0.05)。结论1肝胆管结石并胆管癌组织中c-Met及COX-2的表达较癌旁组织、正常胆管组织明显升高,提示二者在肝胆管结石并胆管癌的发生发展中可能起到了重要的作用。2肝胆管结石并胆管癌组织中c-Met及COX-2的表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移及远处转移灶有明显的相关性,因此推测二者可能与肝胆管结石并胆管癌的恶性程度及侵袭转移密切相关。3使用c-Met抑制剂联合塞来昔布能够降低荷瘤裸鼠肿瘤体积,促进细胞凋亡,推测c-Met及COX-2可能是影响胆管癌肿瘤进展的重要因素。4 c-Met及COX-2的抑制剂可能是肝胆管结石并胆管癌未来潜在的靶点药物,有望为肝胆管结石并胆管癌的辅助治疗带来新的前景。5 c-Met抑制剂PF-2341066和COX-2抑制剂塞来昔布对胆管癌细胞的生长有协同抑制效应,但c-Met与COX-2之间是否存在促进胆管癌血管生成的交叉信号通路还有待更深入的研究。
【关键词】：肝胆管结石 胆管癌 c-Met COX-2 凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.8;R575.7
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 前言22-28
• 第一部分 c-Met与COX-2在肝胆管结石合并胆管癌组织、癌旁胆管组织、肝胆管结石以及正常胆管组织中的表达及其预后相关性的研究28-48
• 引言28-29
• 材料与方法29-35
• 结果35-44
• 讨论44-48
• 第二部分 c-Met抑制剂联合塞来昔布对胆管癌细胞株QBC939的体外作用观察研究48-82
• 引言48
• 材料与方法48-55
• 结果55-74
• 讨论74-82
• 第三部分 c-Met抑制剂联合塞来昔布作用于裸鼠模型的实验效果观察82-101
• 引言82
• 材料与方法82-84
• 结果84-97
• 讨论97-101
• 结论101-102
• 参考文献102-123
• 综述123-133
• 参考文献126-133
• 攻读学位期间成果133-134
• 致谢134-136
• 中英文缩略词136-137

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