NLRP3炎性小体对小鼠结肠炎的作用机制研究

发布时间：2017-10-26 01:38

  本文关键词：NLRP3炎性小体对小鼠结肠炎的作用机制研究

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【摘要】：研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),是慢性的消化道炎症,有克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)两个亚型。越来越多的证据表明IBD是遗传性宿主的黏膜免疫系统对共生菌发生的失调的免疫反应。NOD2/CARD15被发现与人类的克罗恩病相关。此后,便有大量的实验来研究炎性小体在炎症性和自身免疫性疾病中的作用。NLRP3炎性小体是其中研究最多的,它有广泛的激活剂。它的效应是通过IL-1β和IL-18发挥的,在IBD的发生发展中都有很大作用。然而,仍然不确定机体对NLRP3炎性小体是如何调控的。有研究表明ROS可以激活NLRP3炎性小体的组装和活性。因此,关于氧化应激和NLRP3炎性小体的相互作用,以及他们与IBD的关系值得深入研究。目的通过使用氮乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)和二乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate,DDC)来改变IBD模型小鼠的氧化应激状态,检测小鼠结肠和血清中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白及其m RNA表达水平,评估小鼠疾病活动度和结肠组织学改变情况。探讨氧化应激调节剂对NLRP3炎性小体的调节及NLRP3炎性小体在结肠炎中的作用。方法1.模型的建立:SPF级雄性C57BL/6小鼠,6-8周,给予3%葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)自由饮用10天。然后换灭菌水饮用2天。2.实验动物分组:SPF级雄性C57BL6小鼠随机分为4组,每组12只。对照组:给予灭菌水自由饮用10天。模型组:给予3%DSS自由饮用10天。NAC组:除给予3%DSS自由饮用外,于1、3、5、7、9天接受NAC(250mg/kg/d)灌胃治疗。DDC+DSS组:除给予3%DSS自由饮用外,于1、3、5、7、9天接受DDC(250mg/kg/d)灌胃治疗。第11、12天所有小鼠均换用灭菌水自由饮用。3.每天监测小鼠粪便情况和体重,所有小鼠于12天后全部眼球采血处死。收集血清、结肠标本。4.根据小鼠粪便情况和体重改变进行疾病活动度(disease activity index,DAI)评分,用伊红-苏木素染色检测小鼠结肠组织病理改变,行组织学(histochemistry index,HI)评分,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清中的IL-1β和IL-18的表达,用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和western blot检测NLRP3和Caspase-1的表达情况。用Q-PCR检测NLRP3和IL-1βm RNA的表达情况。5.用Graph Pad 6.0统计软件处理数据,所有数据用Levene方差齐性检验,对DAI评分、HI评分、辉度分析及m RNA的相对表达量的比较采用单因素方差分析(ANOVA),对方差分析有意义者再采用LSD-t检验法进行两两比较。对各组免疫组化的结果的比较采用卡方检验,对卡方检验有意义者再采用Fisher确切概率法两两比较。检验水准为α=0.05,P0.05时被认为具有统计学意义。结果1.疾病活动指数(DAI)评分与对照组比较,用DSS诱导的结肠炎模型小鼠有腹泻、便血和体重下降。NAC组症状较模型组轻,DDC组症状较模型组重。四组的DAI评分有差异(F=51.8,P0.05),模型组高于对照组(7.86±0.98 vs 1.49±0.30),NAC组低于模型组(5.82±1.15 vs 7.86±0.98),DDC组高于模型组(9.92±1.63 vs 7.86±0.98),差异有统计学意义(P0.05)。2.组织学(HI)评分与对照组比较,模型组的结肠黏膜固有层有大量的淋巴细胞为主的白细胞浸润,血管增生,隐窝破坏。NAC组的镜下表现较模型组轻,DDC组较模型组重。四组的HI评分有差异(F=69.58,P0.05),模型组高于对照组(6.52±0.67vs 0.50±0.31),NAC组低于模型组(4.58±1.12 vs 6.52±0.67),DDC组高于模型组(8.14±1.15 vs 6.52±0.67),差异有统计学意义(P0.05)。3.血清中的IL-1β和IL-18的表达(ELISA)四组血清的IL-1β的表达有差异(F=23.96,P0.05),模型组高于对照组(86.5±7.88 vs 70.20±7.04),NAC组低于模型组(74.66±3.43 vs 86.5±7.88),DDC组高于模型组(99.15±4.17 vs 86.5±7.88),差异有统计学意义(P0.05)。四组血清的IL-18的表达有差异(F=71.98,P0.05),模型组高于对照组(118.60±2.70 vs 102.20±6.50),NAC组低于模型组(89.40±3.58 vs 118.60±2.70),DDC组高于模型组(128.40±4.56 vs 118.60±2.70),差异有统计学意义(P0.05)。4.NLRP3在结肠的表达(免疫组化法)四组结肠的NLRP3的表达有差异(χ2=16.67,P0.05),模型组高于对照组(75.0%vs 16.7%),NAC组低于模型组(25.0%vs 75.0%),DDC组高于模型组(83.3%vs 75.0%),差异有统计学意义(P0.05)。5.Caspase-1在结肠的表达(免疫印迹法)四组结肠的Caspase-1的表达有差异(F=22.08,P0.05),模型组高于对照组(0.65±0.13 vs 0.33±0.13),NAC组低于模型组(0.36±0.12 vs 0.65±0.13),DDC组高于模型组(0.89±0.13 vs 0.36±0.12),差异有统计学意义(P0.05)。6.NLRP3和IL-1βm RNA在结肠的表达(Q-PCR)四组结肠的NLRP3m RNA的表达有差异(F=145,P0.05),模型组高于对照组(6.17±0.56vs1.35±0.44),NAC组低于模型组(3.11±0.34vs 6.17±0.56),DDC组高于模型组(7.63±0.71vs 6.17±0.56),差异有统计学意义(P0.05)。四组结肠的IL-1βm RNA的表达有差异(F=22.53,P0.05),模型组高于对照组(1.34±0.27vs0.41±0.15),NAC组低于模型组(0.97±0.15vs 1.34±0.27),差异有统计学意义(P0.05)。结论1.予6-8周的SPF级雄性C57BL/6小鼠饮用3%DSS可以成功诱导出结肠炎。2.NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18上调参与小鼠结肠炎的发病,氧化应激抑制剂NAC可以抑制其上调,缓和结肠炎症,而氧化应激激活剂DDC可以促进其上调,加重结肠炎症。
【关键词】：结肠炎 氧化应激 NLRP3 炎性小体
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略词表12-13
• 引言13-16
• 材料与方法16-27
• 1 实验材料16-17
• 2 实验方法17-25
• 3 统计分析方法25-27
• 结果27-34
• 1 疾病活动指数(DAI)评分27
• 2 组织学(HI)评分27-29
• 3 血清中的IL-1β和IL-18 的表达(ELISA)29-30
• 4 NLRP3 在结肠的表达(免疫组化法)30-31
• 5 Caspase-1 在结肠的表达(免疫印迹法)31-32
• 6 NLRP3 和IL-1βm RNA在结肠的表达(Q-PCR)32-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 综述 NLRP3 炎性小体与炎症性肠病的研究进展43-62
• 参考文献57-62
• 个人简历及在校期间发表论文62-63
• 致谢63

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