Akt2与HBV DNA水平相关性及其机制研究

发布时间：2017-10-26 05:06

  本文关键词：Akt2与HBV DNA水平相关性及其机制研究

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【摘要】：目的:本实验的主要目的是研究慢性乙肝病毒性肝炎患者Akt2基因与乙肝病毒载量的关系;探究HBV DNA对Akt2表达的影响;构建并评价慢病毒介导的RNA干扰在人Hep G2.2.15中的基因沉默效应及沉默后乙肝患者中HBV DNA表达情况。方法:收集240例乙肝患者及80名健康人的外周血,利用荧光定量PCR检测乙肝患者血中HBV的病毒载量,将实验对象分为三组,根据HBV DNA病毒载量的高低:将患者分组,HBV DNA1×107拷贝/ml定为高病毒载量组、1×105拷贝/ml≤HBV DNA≤1×107拷贝/ml定为中病毒载量组,HBV DNA1×105拷贝/ml定于低病毒载量组。ELISA法检测4组外周血的Akt2的含量;比较四组中Akt2的表达差异;培养Hep G2及Hep G2.2.15细胞,并提取两类细胞中的RNA,并逆转录成c DNA,采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测两类细胞中Akt2 m RNA的表达水平;设计Akt2的RNAi寡聚核苷酸序列;慢病毒载体构建Akt2的sh RNA载体,转染入大肠杆菌并观察重组表达状况;得到重组腺病毒需要利用293T细胞包装;绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各组对Akt2m RNA的干扰效果。最后采用ELISA法检测实验组与对照组Hep G2.2.15细胞上清液中Akt2的表达水平。结果:80例健康人血清Akt2的含量为292±15ng/ml;低病毒载量组的80例患者其血清Akt2的含量为378±21ng/ml;中病毒载量组的80例患者血清Akt2的含量为537±18ng/ml,而高病毒载量组的80例患者血清中Akt2含量为622±12ng/ml。CHB患者的不同病毒载量组间及与健康对照组对比,其差异均有统计学意义(P1,2,30.001);Hep G2.2.15细胞中Akt2 m RNA的表达水平较Hep G2高,差异有统计学意义(P0.05);筛选了所构建的3个Akt2靶向序列,包装sh RNA慢病毒后转染Hep G2.2.15细胞并检测慢病毒转染后的沉默效率(效率达到85%),比较得出沉默效率最高的靶序列和工作条件。在细胞培养上清液中,实验组的Hep G2.2.15细胞上清液HBV DNA病毒载量为3.63×106拷贝/ml,而对照组中上清液HBV DNA病毒载量为5.17×106拷贝/ml。两组的差异有统计学意义,P0.05。结论:慢性乙型肝炎患者血清Akt2的含量与HBV DNA载量密切相关;HBV能够在m RNA和蛋白水平上调肝癌细胞Akt2的表达;Akt2的表达量降低细胞中HBV DNA的分泌量减少。在临床水平和细胞`水平证实Akt2与乙型肝炎病毒复制密切相关。
【关键词】：慢病毒 Akt2 病毒载量 HBV 基因沉默
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第一部分 慢性乙肝患者血清中Akt2的表达与HBV DNA的关系研究9-15
• 1.1 实验材料9-10
• 1.1.1 主要仪器和设备9
• 1.1.2 主要试剂和器材9-10
• 1.2 实验方法10-13
• 1.2.1 研究对象10
• 1.2.2 血清中HBV DNA载量的测定10
• 1.2.3 实验分组10
• 1.2.4 血清Akt2表达水平的测定10-12
• 1.2.5 统计学分析12-13
• 1.3 结果13-14
• 1.3.1 慢性乙型病毒肝炎患者HBV DNA病毒载量和细胞中Akt2蛋白表达水平的比较13-14
• 1.4 讨论14-15
• 第二部分 Akt2基因在人HepG2和HepG2.2.15中的表达特点15-24
• 2.1 HepG2和HepG2.2.15细胞的培养和观察15-20
• 2.1.1 实验材料15-16
• 2.1.1.0 细胞株15
• 2.1.1.1 主要仪器设备15
• 2.1.1.2 主要试剂和器材15-16
• 2.1.1.3 主要试剂的配制及保存16
• 2.1.2 实验方法16-19
• 2.1.2.1 HepG2和HepG2.2.15细胞的复苏16-17
• 2.1.2.2 HepG2和HepG2.2.15细胞的换液17
• 2.1.2.3 HepG2和HepG2.2.15细胞的传代17-18
• 2.1.2.4 HepG2和HepG2.2.15细胞的冻存18-19
• 2.1.3 结果19-20
• 2.2 HBV对HepG2和HepG2.2.15中Akt2表达的影响20-24
• 2.2.1 实验方法20-23
• 2.2.1.1 人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15细胞中Akt2mRNA的提取20-21
• 2.2.1.2 HepG2和HepG2.2.15细胞总RNA的测定21-22
• 2.2.1.3 逆转录制备cDNA22
• 2.2.1.4 Real-time PCR检测HepG2和HepG2.2.15细胞中Akt2的表达22-23
• 2.2.2 Akt2m RNA 表达量的计算方法23-24
• 第三部分 慢病毒介导的shRNA干扰人HepG2.2.15细胞Akt2基因表达及两组细胞中细胞上清液中HBV的含量24-37
• 3.1 慢病毒介导的shRNA干扰人HepG2.2.15细胞Akt2基因表达24-28
• 3.1.1 实验方法24-28
• 3.1.1.1 慢病毒载体构建24-26
• 3.1.1.2 慢病毒包装及滴度鉴定26
• 3.1.1.3 shRNA慢病毒转染HepG2.2.15细胞26
• 3.1.1.4 验证目的基因的表达26-28
• 3.2 检测实验组与对照组HepG2.2.15细胞上清液中HBV的含量28
• 3.2.1 实验方法28
• 3.3 统计学分析28-29
• 3.4 结果29-35
• 3.4.1 HepG2和HepG2.2.15中Akt2 mRNA的相对表达量29
• 3.4.2 载体质粒构建成功29-32
• 3.4.3 在 HepG2.2.15细胞中评价重组慢病毒载体的干扰活性32-35
• 3.5 讨论35-37
• 第四部分 结论37-38
• 参考文献38-41
• 综述41-50
• 综述参考文献46-50
• 攻读学位期间的研究成果50-51
• 缩略词51-52
• 致谢52-53

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本文编号：1097139