药物性肝损伤体外筛选模型和何首乌致肝损伤的初步研究

发布时间：2017-10-27 20:21

  本文关键词：药物性肝损伤体外筛选模型和何首乌致肝损伤的初步研究

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【摘要】：药物性肝损伤(Drug-induced liver injury, DILI)常常是药物研发失败、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此,无论是上市前还是上市后,对有肝损伤风险的药物,建立有效、灵敏、特异的体外DILI筛选模型显得尤为重要。何首乌作为传统补益类中药的一种,使用十分广泛。药物不良反应数据显示,它具有明显的肝损伤风险。虽然国内外近年来进行了一些基础性研究,但毒性成分目前仍不清楚。因此,需要对何首乌致肝损伤毒性成分及其可能的作用机制进行研究。首先,开展五种肝细胞体外模型的比较研究。选择对乙酰氨基酚、卡马西平、双氯芬酸钠、异烟肼、丙戊酸钠、盐酸胺碘酮、盐酸四环素、利福平、依托泊苷、盐酸拉贝洛尔、达那唑、雷公藤甲素、野百合碱和黄独素B共14个药物为DILI阳性对照,盐酸班布特罗、盐酸丁螺环酮和丁溴酸东莨菪碱共3个药物为DILI阴性对照,采用CCK-8细胞毒性筛选、高内涵筛选和肝相关生化指标筛选等方法,对L-02、 HepG2、 HepaRG和hiHeps等四种人源肝细胞系和一种原代大鼠肝细胞(Primary rat liver cells, PRLs)进行比较研究。结果表明,HepaRG肝细胞系鉴别DIIL药物的能力最高,并依鉴别DILI药物的能力将其排序为HepaRG L-02 HepG2= hiHeps PRLs. HepaRG肝细胞在检测氧化应激、线粒体损伤以及内质网应激等方面灵敏性较高,呈剂量依赖性,优于其他四种肝细胞。在相关性分析和显著性检验中,谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase, MDH)可同时反映双氯芬酸钠、盐酸丁螺环酮和达那唑对HepaRG肝细胞的影响,提示可以作为探索DILI药物的肝损伤相关生物标志物。其次,对何首乌致肝损伤成分进行研究。一方面,我们对何首乌药材进行提取和分离,得到何首乌70%总醇提物和8个提取组分；另一方面,选择易于获得的何首乌所含的16个单体成分作为研究对象。采用CCK-8细胞毒性筛选、UPLC-PAD含量测定以及肝相关生化指标测定等方法,对何首乌70%总醇提物、8个提取组分和16个单体成分进行毒性组分和毒性成分的研究。结果表明,第四组分(Fraction 4, Fr.4)可能为何首乌致肝损伤的毒性组分,没食子酸、白藜芦醇、大黄素、大黄酸为何首乌中具有明显细胞毒性的单体成分。结合L-02肝细胞损伤特征分析和含量分析,推测没食子酸可能是何首乌致肝损伤的主要成分之一。此外,谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GLDH)和γ-谷氨酰转肽酶(y-Glutamyl transferase, y-GT)都反映何首乌70%总醇提物和没食子酸对肝细胞的损伤作用。最后,对没食子酸致肝细胞损伤的初步机理进行研究。分别从细胞周期、细胞凋亡、高内涵筛选(活性氧、线粒体膜电位、内质网应激、中性脂代谢和钙离子稳态)、二维凝胶电泳技术结合分子生物学验证,探索没食子酸在不同剂量和不同时间下对HepaRG肝细胞损伤的机理。结果表明,没食子酸对HepaRG肝细胞的细胞周期没有显著影响;没食子酸呈剂量依赖性的诱导HepaRG肝细胞凋亡；没食子酸呈剂量依赖性和时间依赖性的诱导HepaRG肝细胞内质网应激、降低细胞内活性氧水平和钙离子浓度,对线粒体膜电位和中性脂代谢没有显著影响；没食子酸(0.5mM)在不同时间(24h和48h)处理HepaRG肝细胞,共筛选出11个差异蛋白,其中24h组有6个差异蛋白,48h组有5个差异蛋白。结合GO和Pathway分析,发现24h处理组主要集中在内质网中功能蛋白的折叠和加工方面,48 h处理组主要集中在功能蛋白折叠加工、功能蛋白前体RNA核糖核酸的调控、炎症过程、宿主防御等方面；分子生物学验证结果表明肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A, PPIA)的蛋白表达一致性和基因水平表达的一致性,推测PPIA可能是没食子酸潜在的调控靶点。结论：HepaRG在鉴别DILI药物方面优于其他四种肝细胞(L-02、 HepG2、 hiHeps和PRLs肝细胞)；AST、LDH和MDH可以作为在体外反映DILI药物肝损伤作用的潜在生物标志物。没食子酸可能为何首乌致肝损伤的主要成分之一,其机制可能是通过抑制PPIA的转录和翻译,引起功能蛋白的错误折叠和加工,造成内质网应激,进而导致肝细胞凋亡。
【关键词】：药物性肝损伤 HepaRG细胞系 生物标志物 何首乌 没食子酸 内质网应激 肽基脯氨酰顺反异构酶
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• Abbreviations9-11
• 前言11-17
• 第一章 药物性肝损伤体外模型的筛选17-58
• 第一节 肝细胞的制备和培养17-24
• 第二节 CCK-8细胞毒性筛选24-32
• 第三节 高内涵筛选32-41
• 第四节 肝相关生化指标筛选41-55
• 讨论55-57
• 结论57-58
• 第二章 何首乌致肝损伤毒性成分的筛选58-94
• 第一节 何首乌70%总醇提物和8个组分的制备以及16个单体成分的购置58-61
• 第二节 CCK-8细胞毒性筛选61-71
• 第三节 大黄素、大黄酸、白藜芦醇和没食子酸的含量测定71-79
• 第四节 肝相关生化指标筛选79-89
• 讨论89-93
• 结论93-94
• 第三章 何首乌致肝损伤成分的作用机制研究94-148
• 第一节 细胞周期检测94-97
• 第二节 细胞凋亡检测97-103
• 第三节 高内涵筛选103-108
• 第四节 二维凝胶电泳分析108-120
• 第五节 Western blot验证120-131
• 第六节 q-RT-PCR验证131-145
• 讨论145-147
• 结论147-148
• 第四章 研究总结148-150
• 参考文献150-158
• 综述158-171
• 参考文献166-171
• 博士在读期间所获成果171-172
• 致谢172-173
• 附录173-231

【参考文献】

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1 宋海波;杜晓曦;郭晓昕;任经天;杨乐;逄瑜;;基于中医药古籍的何首乌安全性及风险因素分析[J];中国中药杂志;2015年05期

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本文编号：1105062