pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

发布时间：2017-10-29 07:25

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【摘要】：目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。结果使用本文优化的方法,细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示:相对于正常组,在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞;其NTCP表达均显阳性(P0.01);且稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高(P0.05)。结论高效快速地建立了稳定高表达NTCP的HEK293细胞系,为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。
【作者单位】： 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心;贵州医科大学药学院;国家苗药工程技术研究中心;贵州省药物制剂重点实验室;
【关键词】： NTCP EGFP 稳定转染 牛磺胆酸 HEK细胞 高效快速
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No 81460523) 贵州省优秀青年科技人才培养对象专项基金(No 2013-45号) 贵州省社会发展攻关计划项目(No 2013-3031号) 贵州省中药现代化科技产业研究开发专项(No 2013-4001号) 贵州省科学技术基金(No黔科合J字[2014]2018号)
【分类号】：R575
【正文快照】： 胆汁酸在肝脏中合成并储备在胆囊,在食物的刺激下被肠道吸收,至回肠末端被肠壁吸收后,经门静脉重新进入肝脏,被肝细胞摄取后再次分泌,进行肝肠循环[1]。研究发现,在肝肠循环中肝细胞对胆汁酸的摄取具有靶向性。而多数治疗肝病的药存在肝细胞富集能力差,对非靶器官毒性较大等缺

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本文编号：1112011