脂质自噬在BPA所致肝脏脂质沉积中的作用研究

发布时间：2017-11-01 14:01

  本文关键词：脂质自噬在BPA所致肝脏脂质沉积中的作用研究

  更多相关文章： 脂质自噬 双酚A 脂质沉积 自噬

【摘要】：目的：环境内分泌干扰物双酚A (Bisphenol A, BPA)可促进肝脏脂质沉积,但其机制尚不清楚。而脂质自噬减弱可导致肝脏脂质沉积的发生,其是否介导BPA所致的肝脏脂质沉积,目前尚不清楚,本研究通过体内外模型揭示脂质自噬在BPA所致肝脏脂质沉积中的作用。方法：在体外实验中,将HepG2细胞分为对照组、BPA不同浓度(1、0.001、1、4、10μM)干预组、阳性对照组即200μM油酸(Oleic acid,OA)联合400μM软脂酸(Palmitic acid, PA)。分别给予上述不同干预24h。采用化学酶促-比色法定量检测细胞内甘油三酯(Triglyceride, TG)含量,油红O及Bodipy 493/503荧光染色观察细胞内脂滴,以明确体外脂质沉积模型构建是否成功。Real-time PCR及Western blot、免疫荧光等方法检测在不同干预情况下HepG2细胞内与自噬相关的指标LC3、P62的表达水平,透射电镜观察自噬体数量,并对自噬的各个阶段进行分析：①自噬的启动阶段：Western blot等方法检测p-mTOR、p-ULK1、Atg5表达水平；②自噬体与溶酶体融合阶段：免疫荧光检测LC3与LAMP1共定位；③溶酶体降解阶段：AO染色检测溶酶体酸度、Calthepsin L表达水平。进一步用10μMBPA干预原代肝细胞,对上述部分关键结果进行验证。在体内实验中,分别用不同浓度BPA (5、50、500μg/kg/day)喂养CD1小鼠42天后,检测肝脏脂质沉积,从体内验证脂质沉积模型是否成功建立,并进一步对自噬相关指标进行检测,从体内对体外相关结果进行验证。结果：体外HepG2肝细胞及原代肝细胞中：1、不同浓度干预后,细胞内TG含量不同程度增加,其中10μM BPA组升高具有统计学意义(p0.05)。油红O染色及Bodipy 493/503脂滴染色结果与TG结果一致。2、Western blot及免疫荧光结果显示,与对照组相比,10μMBPA干预后LC3-Ⅱ的表达明显增加,.同时与自噬降解关系密切的蛋白P62表达亦增加,加用抑制剂CQ阻断自噬体降解后,BPA组LC3-Ⅱ的表达较单用CQ组降低,自噬通量受损。透射电镜观察到10μM BPA组自噬体数量堆积。3、对自噬过程的各个阶段进行检测后发现：a、启动阶段：10μMBPA干预后p-ULK1、p-mTOR表达增加,Atg5表达减少(p0.05)；b、融合阶段：10μMBPA干预后LC3与LAMP1融合减少；c、溶酶体降解阶段：与对照组相比,10μM BPA干预组AO染色荧光小点明显减少,溶酶体酸度明显减弱；Cathepesin L蛋白表达减少(p0.05)。体内试验中,与对照组相比,50、500μg/kg/day BPA干预组CDl小鼠肝脏中TG含量明显增加(p0.05),油红O染色结果与TG结果一致；与对照组相比,BPA 500组LC3-Ⅱ表达、P62表达明显增加,Cathepesin L蛋白表达减少(p0.05)。结论：在体内与体外实验中,我们发现BPA可导致肝脏脂质沉积,同时自噬启动、自噬体与溶酶体融合、溶酶体功能及对自噬体降解作用减弱。自噬通路受损,自噬体堆积。这些结果表明,在BPA所致的肝脏脂质沉积中,脂质自噬可能参与了BPA所致的肝脏脂质沉积。
【关键词】：脂质自噬 双酚A 脂质沉积 自噬
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 1 材料与方法14-34
• 2 实验结果34-49
• 3 讨论49-53
• 全文总结53-54
• 参考文献54-57
• 文献综述57-68
• 参考文献64-68
• 致谢68-69
• 硕士期间发表的论文69

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本文编号：1127099