人肝再生增强因子在pichia pastoris中表达、纯化及活性检测

发布时间：2017-11-05 07:35

  本文关键词：人肝再生增强因子在pichia pastoris中表达、纯化及活性检测

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【摘要】：目的：建立一套便于纯化的肝再生增强因子真核表达系统,为后续更好地研究肝再生增强因子的生物学功能奠定基础。方法：1.用基因重组技术和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法,从重组质粒pPIC9K-rhALR中扩增出编码rhALR的基因片段。纯化后的ALR基因和pPICZαA空质粒,分别经限制性内切酶Xho I和Xba I双酶切。酶切产物纯化后进行DNA连接酶连接,构建重组质粒pPICZaA-rhALR。2.经PCR、双酶切和测序鉴定的重组质粒pPICZaA-rhALR,由限制性内切酶SacI单酶切线性化后电转入酵母菌GS115中,在含博来霉素(Zeocin)的YPD平板上筛选阳性转化子,随后再在含Zeocin浓度递增的YPD板上筛选高拷贝子。酵母菌落PCR鉴定后的高拷贝菌,在1%甲醇诱导下,分泌表达rhALR。表达上清蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot(ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体)鉴定。3.表达上清经镍柱亲和层析纯化,再用截留分子量为7kD的透析袋予以透析处理。SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化效果,BCA试剂测得目的蛋白浓度。4.MTS试剂检测rhALR体外对人肝癌细胞(HepG2、QGY)的促增殖活性,及其对顺铂处理的QGY细胞增殖抑制率影响。流式细胞仪检测rhALR在顺铂(DDP)诱导肝癌细胞株QGY凋亡时的抗凋亡作用。结果：1.成功构建rhALR 15kD亚型酵母表达重组质粒pPICZaA-rhALR。重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定均与预期结果一致。2.成功构建pPICZaA-rhALR GS115真核表达系统。在含Zeocin 2000μg/ml YPD板中筛出多颗高拷贝菌,菌落PCR鉴定重组菌为Mut-型,即甲醇利用正常型。rhALR被分泌表达于上清,占上清总表达蛋白的70%以上,Western Blot均可见单一的分子量约为17.5 kD的条带。3.SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化后产物,可见单一的,浓缩的目的蛋白条带。BCA试剂测得超滤浓缩后目的蛋白浓度约为(800-1600)μg/ml。4.MTS试剂测得rhALR对HepG2细胞和QGY细胞的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强,也可浓度依赖式缓解顺铂处理的QGY细胞增殖抑制率。而流式细胞仪检测法测得其对顺铂诱导的人肝癌细胞亦有呈浓度梯度式的抗凋亡作用。结论：成功构建能高效分泌表达rhALR的pPICZaA-rhALR GS115酵母表达系统,表达产物易于镍柱亲和纯化。体外实验证实该系统表达的rhALR具有良好的生物活性。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575

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本文编号：1143257