肝纤维化大鼠肝组织及血液微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的影响

发布时间：2017-11-13 02:33

  本文关键词：肝纤维化大鼠肝组织及血液微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的影响

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【摘要】：目的：本课题组的前期研究证明肝功正常的大鼠肝组织匀浆上清液可诱导人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, HUCMSCs)定向分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞,考虑到干细胞在移植后可随血液循环“归巢”于损伤靶器官的特点,我们推测纤维化肝组织微环境也许更有利于干细胞向肝细胞的定向分化。本研究拟采用大鼠纤维化肝组织匀浆上清液体外模拟纤维化肝组织微环境对HUCMSCs进行诱导培养,从细胞形态、肝细胞表面标志物、肝细胞功能等方面评价其在特定微环境下的分化潜能,并进一步平行比较纤维化肝组织微环境与正常肝组织微环境及肝纤维化大鼠血液微环境与正常大鼠血液微环境诱导HUCMSCs向肝细胞分化的效果，旨在为干细胞移植治疗肝纤维化提供理论依据和实验基础。方法：1.大鼠纤维化肝组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究采用腹腔注射3%硫代乙酰胺生理盐水溶液(200mg/kg,2次/周,共4周)的方法制备SD(Sprague Dawley)大鼠肝纤维化模型,取造模成功的大鼠肝脏制备肝组织匀浆上清液。取第三代HUCMSCs进行分组培养：①对照组：含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)的DMEM/F12培养基;②纤维化肝组织匀浆组：含10%FBS及50g/L纤维化肝组织匀浆上清液的DMEM/F12培养基。诱导开始后于倒置显微镜下观察并记录细胞形态学变化;取对照组及诱导7d的纤维化肝组织匀浆组细胞,采用Western Blot法检测细胞角蛋白18(Cytokeratin 18, CK18)、甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein, AFP)、CYP3A4的表达情况，采用过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff, PAS)染色检测细胞储存糖原的能力，分别采用二乙酰肟比色法及酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)法测定两组细胞培养液中尿素(Blood Urea Nitrogen, BUN)及白蛋白(Albumin, ALB)的含量。2.纤维化肝组织微环境与正常肝组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化效果的比较研究将第三代HUCMSCs进行分组培养：①对照组：含10%FBS的DMEM/F12培养基;②纤维化肝组织匀浆组：含10%FBS及50g/L纤维化肝组织匀浆上清液的DMEM/F12培养基。③正常肝组织匀浆组：含10%FBS及100g/L正常肝组织匀浆上清液的DMEM/F12培养基。诱导开始后于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化：取对照组及诱导7d的匀浆组细胞采用Western Blot法检测CK18、AFP、CYP3A4、 CYP2E1、CYP2D6、色氨酸2，3-双加氧酶(Tryptophan2,3-Dioxygenase, TPH2)的表达情况，采用ELISA法测定各组细胞培养液中ALB的含量。3.肝纤维化大鼠血液微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究分离肝纤维化大鼠和正常大鼠血清。取第三代HUCMSCs进行分组培养：肝纤维化大鼠血清组：含5m1/L肝纤维化大鼠血清的DMEM/F12(含10%FBS)培养基：正常大鼠血清组：含5m1/L正常大鼠血清的DMEM/F12(含10%FBS)培养基。对照组：DMEM/F12(含10%FBS)培养基。诱导开始后于倒置显微镜下观察并记录各组细胞形态学变化：取诱导7d时的各组细胞,采用细胞免疫荧光检测AFP、CK18的表达，采用Western Blot法检测ALB、TPH2、CYP3A4的表达，采用二乙酰肟比色法测定各组细胞培养液中BUN的含量。结果：1.本研究第一部分，与对照组长梭形细胞相比,纤维化肝组织匀浆组细胞于诱导1d时即可见到细胞两极回缩,胞体变短;诱导7d时,细胞呈不规则形或类圆形,胞体丰满。Western Blot检测示,对照组细胞未见AFP、CK18、CYP3A4表达;匀浆组细胞可表达肝细胞表面标志物AFP、CK18及与代谢功能相关的重要蛋白CYP3A4.对照组上清液中BUN、ALB浓度分别为(0.43±0.07)mmol/L和(8.08±0.41)μg/mL,匀浆组分别为(2.52±0.20)mmol/L和(41.48±4.11)μg/mL,比较差异均有统计学意义p0.01;p＜0.01)。PAS染色示,对照组HUCMSCs细胞核呈深蓝色,细胞质呈淡紫色;匀浆组细胞整个胞体被染成深紫色,细胞核可见。2.本研究第二部分,与对照组长梭形成纤维样细胞相比,诱导7d时,纤维化肝组织匀浆组及正常肝组织匀浆组细胞形态变化明显,呈类圆形,胞体丰满。与对照组相比，两匀浆组细胞均可表达肝细胞表面标志物CK18和AFP。对照组细胞可表达少量CYP2E1,两匀浆组细胞可表达CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2等肝细胞功能蛋白，，且CYP2E1的表达量较对照组明显增加(p＜0.01),而两匀浆组上述蛋白的相对表达量差异无统计学意义p0.05)。同时,两匀浆组细胞分泌ALB的能力较对照组亦明显增强(p＜0.01),两匀浆组相比差异无统计学意义p0.05)。3.本研究第三部分,诱导7d时,各组细胞均未见到明显的形态学变化。肝纤维化大鼠血清组细胞可表达AFP、CK18等肝细胞标志物及其功能蛋白ALB、THP2、 CYP3A4,正常大鼠血清组和对照组细胞不表达上述蛋白。正常大鼠血清组细胞上清液中BUN浓度为(0.40±0.04)mmol/L,对照组为(0.38±0.04)mmol/L,两组差异无统计学意义(p0.05)。肝纤维化大鼠血清组BUN浓度为(0.74±0.07)mmol/L,显著高于前两组(p＜0.05)。结论：1.大鼠纤维化肝组织微环境可快速诱导HUCMSCs向肝细胞分化,形成的肝样细胞不仅具备肝细胞表面标志物,同时有肝药酶的表达,并具有储存糖原、合成BUN及分泌ALB的能力,可部分替代肝细胞功能,这可能是干细胞移植改善肝功能的机制之一。2.纤维化肝组织微环境与正常肝组织微环境均可诱导HUCMSCs向肝细胞分化，在达到相同诱导效果时,与正常肝组织相比,纤维化肝组织所需组织液浓度更低,提示纤维化肝组织微环境可能更有利于HUCMSCs向肝细胞分化。3.肝纤维化大鼠血液微环境可诱导HUCMSCs向肝细胞分化,体外诱导7d时,细胞没有发生明显的形态学变化,但可以表达肝细胞标志物AFP、CK18及其功能蛋白ALB、TPH2、CYP3A4,且BUN合成功能显著增强,提示在肝纤维化条件下,移植HUCMSCs可能在入血后即已开始向肝细胞分化。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2

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本文编号：1178743