不同浓度的肿瘤坏死因子-α在急性肝损伤中的双重作用及机制研究

发布时间：2017-11-26 13:32

  本文关键词：不同浓度的肿瘤坏死因子-α在急性肝损伤中的双重作用及机制研究

  更多相关文章： 急性肝损伤 四氯化碳 肿瘤坏死因子 TNFR2融合蛋白变异体

【摘要】：研究背景及目的:急性肝损伤是临床上较为常见的一种疾病,发病急、进展快、病情重是其特点,因此亟需明确诊断和治疗。它是介于恶化和康复转归的一种特殊临界状态,如果治疗及时,肝损伤很可能得以控制,并逐渐转愈;反之,则可能恶化,甚至转变为肝衰竭,严重危害健康。急性肝损伤可由多种疾病发展而来,如病毒性肝炎、药物性肝损伤、肝切除、肝移植、内毒素性肝损伤、肝缺血再灌注等。这些疾病通常会引起肝细胞血流的改变,进而造成不同程度的肝细胞缺氧,从而引起肝组织的损伤。炎症微环境对组织损伤的发生发展具有重要的作用。而基于对调控炎症微环境治疗损伤性疾病越来越受到重视。急性肝损伤的发病机制极其复杂,其病情的发生和发展和炎症微环境的改变密切相关。早期阶段,肝组织内的库普弗细胞(Kupffer细胞)和巨噬细胞被激活后释放活性氧(reactive oxygen species,ROS)和一些炎症因子,如白介素类和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)。其中TNF-α在调节急性肝损伤过程中发挥着重要的作用。TNF-α是一种具有多态性的细胞因子,能调节炎症、细胞凋亡、新陈代谢等。TNF-α的这些生物活性和其重要的调节功能,与急性肝损伤的发生发展密切相关。研究表明在急性肝损伤的发生发展过程中,TNF-α大量生成并启动和调节其它炎症因子的生成;同时TNF-α快速进入损伤的肝细胞中,诱导启动核转录因子kappa B(nuclear factor-κB,NF-κB)的信号通路的表达,共同参与肝细胞的修复过程。然而,有一些文献报导TNF-α在急性肝损伤过程中,加重损伤的恶化。它通过激活肝细胞内的一系列信号通路,最终启动凋亡程序加速肝细胞的死亡。另外有文献报导临床上患者血清中TNF-α升高与病情恶化的程度呈正相关性。尽管目前对TNF-α的研究有着比较深入的了解,但是对于TNF-α在急性肝损伤的具体作用尚不明确。基于上述研究背景,我们实验对此进行了深入研究。首先制备了四氯化氮(Carbon tetrachloride,CCl_4)皮下注射诱导大鼠急性肝损伤模型;并应用不同剂量的TNF-α抑制剂TNFR2融合蛋白变异体(TNFR2-Fc variants,TNFR2-Fcv,是一种基因合成的可溶性蛋白,能与TNF-α结合并抑制其活性)来观察不同浓度的TNF-α对急性肝损伤的作用,并探索可能的机制。研究方法:(1)急性肝损伤模型的制备:CCl_4溶解在玉米油中,配制成40%的浓度。先将TNFR2-Fcv溶液腹腔注射到不同分组的雄性SD大鼠体内。15分钟以后,再将1ml/kg的CCl_4皮下注射到相应组的大鼠体内。24小时以后,大鼠全部被处死,收集血液和分离新鲜的肝组织,用于后续的实验。(2)实验分组及处理:将90只体重在200至210g之间的雄性SD大鼠,随机分为9组,平均每组10只。这些大鼠分别予以CCl_4(-)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(-)+8mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+0.25mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+0.5mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+1mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+2mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+4mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+8mg/kg TNFR2-Fcv处理;同时我们采用TNF-α-/-大鼠给予1ml/kg的CCl_4皮下注射并将这些处理组的大鼠放置在SPF级动物房饲养。辅以25±3°C的室温下,12小时昼夜交替光照,并配以标准的饲料和清洁的饮水。(3)血清TNF-α水平的检测:用ELISA检测分析不同剂量的TNFR2-Fcv作用于急性肝损伤大鼠后,血清中TNF-α的浓度,以明确体内不同浓度的TNF-α对急性肝损伤的作用。(4)肝损伤的检测:从血液中析出血清,在自动分析仪中检测各组血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)的水平。将肝组织石蜡包埋后制成组织切片,HE染色分析各组肝组织切片的脂肪变性程度;免疫组化技术和Tunnel试剂盒检测组织切片中Cleaved-caspase3的表达和肝细胞凋亡的水平,判断各组肝损伤的程度。(5)炎症因子水平的检测:实时定量PCR(Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测急性肝损伤过程中,体内不同浓度TNF-α对炎症因子如IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ等的表达影响。(6)NF-κB信号通路及抗凋亡基因的检测:Western-Blotting检测不同浓度的TNF-α在急性肝损伤过程中NF-κB信号通路的表达包括IκBα(inhibitor of NF-kappa B-α)、p-IκBα(Phospho-IκBα)和NF-κB-p65的表达。以及RT-PCR和Western-Blotting检测相关抗凋亡基因的表达如BCL-2(B-cell leukemia lymphoma 2)、BCL-XL(B-cell lymphoma-extra large)、XIAP(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein),和FHC(Ferritin heavy chain)。(7)统计学分析:数据结果采用统计软件SPSS 20.0进行统计分析,各组之间的均数标准误采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)进行检验分析,以P0.05为差异有统计学意义,两组之间的差别采用Student-T检验,P0.05有统计学差异。研究结果:(1)在CCl_4诱导的大鼠急性肝损伤模型中,血清TNF-α的浓度随着TNF-α抑制剂TNFR2-Fcv剂量的增加而逐渐下降,呈明显的相关性。(2)在CCl_4诱导的大鼠急性肝损伤模型中,血清ALT和AST明显上升,即ALT:从36.75±8.73 U/L上升至193.27±14.26 U/L;AST:从150.86±12.34 U/L上升至253.79±12.90 U/L,p0.01。HE染色发现肝组织中有大量的脂肪变性,同时免疫组化染色Cleaved-caspase3阳性的细胞数量明显增多、Tunnel凋亡试剂染色发现凋亡的肝细胞数目增多和Western-Blotting检测凋亡抗体表达增强。(3)在正常大鼠中,无论TNF-α抑制剂TNFR2-Fcv剂量如何改变,血清ALT和AST水平基本不变,基本处于正常范围之内。而在CCl_4诱导大鼠的急性肝损伤模型中,随着TNFR2-Fcv的剂量从0mg/kg逐渐递加到8mg/kg时,体内TNF-α水平逐渐下降,血清ALT和AST水平的变化呈明显的“V”字型改变,即TNFR2-Fcv从0mg/kg增加至1mg/kg时,血清ALT和AST的值逐渐下降(P0.01);HE染色发现肝细胞脂肪变性的程度减轻;免疫组化和Tunnel检测到凋亡的肝细胞数目明显减少(P0.05)。然而,随着TNFR2-Fcv的剂量进一步加大,从1mg/kg增加至8mg/kg时,TNF-α的浓度继续降低(至8mg/kg时,TNF-α接近于0pg/ml),血清ALT和AST的值反而逐渐上升,甚至在8mg/kg时,ALT和AST水平较0mg/kg时要高(P0.05);HE染色发现肝细胞脂肪变性的程度反而加重;免疫组化和Tunnel检测到凋亡的肝细胞数目也大幅度增多(P0.05)。(4)在TNF-α-/-的大鼠中,CCl_4诱导急性肝损伤时,血清ALT和AST水平较野生型正常大鼠的明显升高(P0.01);HE染色观察到单视野肝脂肪变性十分严重。(5)RT-PCR的结果提示在急性肝损伤过程中,随着TNFR2-Fcv剂量的增加,TNF-α浓度逐渐下降,促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ水平逐渐下降,而抑炎因子IL-4的水平反而逐渐上升。(6)Western-Blotting和RT-PCR实验结果表明在急性肝损伤过程中随着TNF-α浓度逐渐下降,NF-κB信号通路基因p-IκBα和NF-κB-p65的表达以及抗凋亡基因包括Bcl-XL、FHC、XIAP和Bcl-2的表达也逐渐下降。结论:(1)TNF-α在调节急性肝损伤过程中发挥着重要的作用,适当地降低体内TNF-α浓度可有效地缓解肝损伤,然而,过度地降低TNF-α浓度反而会加重肝损伤。(2)TNF-α的损害和保护的双重作用始终贯穿在急性肝损伤的发生和发展过程。其浓度与主要发挥的效应密切相关。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 童英,阎向东,吴少平,姚小曼;乙醇急性肝损伤敏感指标的研究[J];中华预防医学杂志;2000年03期

2 陆祖福,黄芳,汪家梨,曾毅丹,吴小南;慈菇对镉致小鼠急性肝损伤的保护作用[J];福建医科大学学报;2001年02期

3 张伟,杨建辉;中医药抗急性肝损伤的研究近况[J];江西中医药;2005年06期

4 黎创幸;;三黄制剂对小鼠急性肝损伤的影响[J];现代食品与药品杂志;2006年03期

5 杨坤;韩燕全;鲁小杰;张东升;杨新波;黄正明;;芹龙颗粒抗急性肝损伤的实验研究[J];解放军药学学报;2007年05期

6 单静喜;任江;姜树民;;急性肝损伤研究近况[J];辽宁中医药大学学报;2008年01期

7 杨莉莉;董文;贺巾超;任秀宝;颜炜群;;重组牛胰蛋白酶抑制剂对小鼠急性肝损伤的保护作用[J];中国药理学通报;2008年04期

8 李俊松;余宗亮;王明艳;蔡宝昌;;山茱萸炮制前后对小鼠急性肝损伤保护作用的研究[J];南京中医药大学学报;2008年04期

9 何光力;刘洁;潘嘉;艾丽;彭龙玲;;肝舒胶囊对急性肝损伤动物的保护作用[J];华西药学杂志;2009年06期

10 姚莹华;刘强;陈育尧;孙学刚;吕志平;;丹参多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用[J];中国实验方剂学杂志;2010年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王俊平;杨颖;李红霞;张瑾;冯秋玲;;急性肝损伤鼠~(13)C-美沙西丁呼气试验的研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）[C];2007年

2 胡建平;赵诗云;;肝复康片对小鼠急性肝损伤的保护作用[A];首届江西省科协学术年会江西省中医药学术发展论坛论文集[C];2010年

3 李娟;张逢源;李江;闫乾顺;姚遥;;多枝柽柳醇提物对小鼠急性肝损伤的保护作用[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

4 李三强;杜景霞;朱沙;;热休克预处理对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的保护作用[A];2013年（第三届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年

5 刘隽;黄建钊;范伟;张毅;张莹;石承先;张德林;冯新富;宋陆军;秦新裕;;骨髓细胞移植治疗小鼠急性肝损伤的实验研究[A];2007年贵州省医学会外科分会学术年会论文汇编[C];2007年

6 李秋影;李欣欣;莫红梅;曹晶;周水平;郭志昕;;水飞蓟宾及卵磷脂抗小鼠急性肝损伤研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

7 吕正兵;李谦;叶波平;边杉;王颖;阮期平;吴梧桐;;鲨肝活性肽对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年

8 李燕君;尚芳红;王森弘;李莉;徐晓玉;;银天颗粒对小鼠急性肝损伤保护作用研究[A];化学与创新药物——2013年中国化学会产学研合作研讨会会议论文集[C];2013年

9 王春妍;胡东胜;;大承气汤对急性肝损伤大鼠肠源性内毒素血症的干预作用[A];第十八次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2009年

10 王春妍;曹武奎;李海;;核因子-κB在急性肝损伤中作用及机制研究[A];第一届全国疑难重型肝病大会、第四届全国人工肝及血液净化学术年会论文集[C];2008年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 郑晨宏;CD24分子在刀豆蛋白A诱导小鼠急性肝损伤中的作用及机制研究[D];中国人民解放军医学院;2016年

2 邹珊珊;β-连环蛋白在TNF-α和Fas诱导急性肝损伤中的双重作用机制研究[D];第二军医大学;2013年

3 霍亚珍;Antcin H对APAP或GalN/TNFα诱导的急性肝损伤的保护作用及其机制的研究[D];中国农业大学;2016年

4 何勇;肝脏线粒体DNA-TLR9-microRNA223环路负反馈调节对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤和炎症的机制研究[D];安徽医科大学;2016年

5 郭尹玲;从“湿热变证”论治急性肝损伤的动物实验研究及机制初探[D];成都中医药大学;2010年

6 刘文军;严重创伤后肾缺血再灌注与急性肝损伤的保护性研究[D];昆明医学院;2008年

7 詹亦贝;5'-AMP对哺乳动物急性肝损伤保护作用的研究[D];南京理工大学;2014年

8 王春妍;急性肝损伤肠源性内毒素血症的基础研究及药物干预[D];吉林大学;2007年

9 刘隽;骨髓细胞移植治疗小鼠急性肝损伤的实验研究[D];复旦大学;2007年

10 赵冰洁;加味达原饮对急性肝损伤湿邪内蕴证模型大鼠的治疗作用研究[D];成都中医药大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 宋昊;草苁蓉乙醇提取物对扑热息痛诱导小鼠急性肝损伤的保护作用[D];延边大学;2015年

2 齐军;4-苯基丁酸对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的影响[D];安徽医科大学;2015年

3 李琰;渥曼青霉素对LPS/D-GalN诱导急性肝损伤中肝组织坏死、凋亡及自噬的影响[D];山东大学;2015年

4 闫春雷;急性肝损伤大鼠肝脏11β-HSD1基因和蛋白质表达的变化及其与转氨酶相关性研究[D];山东大学;2015年

5 刘德明;水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的保护作用研究[D];广东药学院;2015年

6 陶英贤;左卡尼汀对丙戊酸钠诱导的大鼠急性肝损伤的保护作用研究[D];佳木斯大学;2015年

7 许元宝;脂多糖预处理减轻对乙酰氨基酚所致急性肝损伤[D];安徽医科大学;2014年

8 卞晶晶;骨髓间充质干细胞移植对急性肝损伤的治疗作用与NF-κB和CUGBP1的表达[D];青岛大学;2015年

9 庞文箫;蝉翼藤提取物甲基阿魏酸对四氯化碳急性肝损伤小鼠模型保护作用及其机制研究[D];桂林医学院;2015年

10 车倩;糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖减轻LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤[D];重庆医科大学;2015年

，

本文编号：1229985