丁酸盐减少IL-10基因敲除小鼠致肠炎的IgA包裹性细菌及改善肠道菌群结构

发布时间：2017-12-05 16:05

  本文关键词：丁酸盐减少IL-10基因敲除小鼠致肠炎的IgA包裹性细菌及改善肠道菌群结构

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【摘要】：研究背景：炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病变可涉及整个消化道的病因不明的慢性肠道炎症性疾病,主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,病变主要累及末端回肠和结肠。尽管IBD的病因尚未明确,但普遍认为肠道内菌群失调是IBD重要的发病机制之一。随着科学技术的发展,菌群的培养及分析的方法日益先进,使人类对于肠道菌群的分析也更加精确,从而为人类对微生物的进一步了解打下坚定的基础。而近年出现的分析细菌的16S rRNA序列已经成为细菌菌种鉴定方法的“金标准”。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善,16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善,应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。目前的研究发现,IBD患者或动物实验小鼠模型的肠道的菌群结构往往表现为菌群紊乱和生物多样性的减少,如肠道内厚壁菌门细菌和柔嫩梭菌比例比正常健康人群的细菌的比例低,而拟杆菌门细菌和肠杆菌科细菌的比例比正常人群的比例是有所增加的；更有发现某些特定的细菌可以使肠道的肠炎或结肠炎加重,如普雷沃什菌属和螺杆菌属,但是这却并不具有普遍性的特点,往往个体性差异较大,将这种结果应用到其他个体是不太相同,甚至是相反的。因此,这种具体到某种细菌的结果又无法揭示炎症性肠病的病因。直至近期,有研究发现存在一类细菌可与免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)结合并且被包裹,实验将IBD患者的粪便中筛选并培养出这一类细菌,这种能够被IgA包裹的细菌经过灌胃后能够使DSS诱导的无菌小鼠的结肠炎症加重,而若是选用不能被IgA包裹的细菌灌胃后的这种小鼠却没有炎症加重的现象。因此,这类被IgA包裹的细菌可能是导致炎症性肠病的致病性细菌。IgA是一类主要在黏膜表面分泌且能与肠道微生物的片段结合的一类抗体。IgA能够调节机体的免疫力来抵抗肠道中的病原体,如病毒、细菌和毒素,也能对机体稳态起到维持作用,研究发现缺乏IgA分泌的人类和小鼠更加容易患有IBD、乳糜泻和过敏性疾病。IgA还通过调节机体共生菌群的组成、基因表达和菌群动力等作用来影响宿主肠上皮细胞的生理功能和免疫功能。由此可知,寻找可以减少IgA包裹性细菌的方法可能是作为治疗IBD的一个有效手段。饮食被认为是影响肠道菌群最重要的因素之一,故越来越多的研究想要寻找出是否存在某些物质或方法能够使受到破坏的菌群结构重新建立,从而恢复机体正常菌群结构和保证机体健康。近些年来,新的方法不断涌现,如粪菌移植,这是通过将健康人群的粪便细菌移植给一些菌群结构紊乱的患者中来治疗患者的疾病的方法。此外,膳食纤维、益生元和益生菌也越来越受到人群和医疗结构的青睐,不仅作为健康产品,同时研究中的应用也更加广泛。研究发现,可溶性膳食纤维在IBD患者和动物模型中对于肠炎具有抗炎的作用,但背后的机制却尚不明确。我们知道,可溶性膳食纤维在结肠细菌的作用下可产生短链脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短链脂肪酸对于维持结肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用。此外,有研究发现在IBD患者及动物模型中产丁酸菌的数量与正常人群相比有明显降低,同时伴随着丁酸代谢和产量的减少。短链脂肪酸特别是丁酸可以通过调节结肠调节性T细胞的免疫功能起到抗结肠炎的作用。那么,丁酸能否对肠道菌群产生影响呢?从以上的研究和数据中我们可以发现丁酸确实是对肠道的炎症、正常功能、能量提供和免疫功能等产生影响的,但是产生这些影响的背后机制,特别是对肠道菌群的影响的具体研究却是不多的。丁酸是否对于肠道的细菌的结构组成和生物多样性产生作用,是否因此对产丁酸的菌群以及其他益生菌有影响,这些我们都不知道。本课题进行研究的初衷就是基于以上这些原因才产生的,希望能够解答部分我们尚不知道的现象的原因。因此,我们假设丁酸盐可能通过影响肠道菌群的结构以及减少肠道内致肠炎的IgA包裹性的细菌来减轻IBD动物模型IL-10基因敲除小鼠的炎症。材料与方法：我们选取8周龄的野生型C57BL/6小鼠4只及同样周龄的IL-10基因敲除小鼠8只,将IL-10基因敲除小鼠随机分成两组,每组各4只。实验组的IL-10基因敲除小鼠每天予喂食丁酸盐(100M)的水溶液；无干预措施组的IL-10基因敲除小鼠和空白对照组野生型小鼠均予喂食普通饮用水。在相同的饲养环境下饲养4周后处死并立即取结肠组织和结肠粪便进行相关的实验。取各组小鼠的结肠组织用苏木精-伊红染色法染色以及免疫荧光方法观察结肠组织的炎症,采用实时定量PCR方法检测炎症因子白介素(interleukin,IL)-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-a的mRNA基因的相对表达来测定炎症因子的表达水平；取各组小鼠的结肠粪便采用气相色谱分析方法测定小鼠结肠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量；采用16S rRNA基因测序的方法对各组小鼠结肠粪便的菌群结构进行分析；选用流式细胞术的方法对各组小鼠结肠粪便中IgA包裹性细菌的含量进行检测。研究结果：给予喂食丁酸盐后的IL-10基因敲除小鼠的结肠组织炎症比IL-10基因敲除小鼠无干预措施组的炎症程度明显减轻,同时结肠炎症评分也明显降低(1.25±0.50 vs.2.5±0.58分,p=0.025)；炎症指标IL-6和TNF-a表达水平在喂食丁酸盐的IL-10基因敲除小鼠实验组也明显下降(分别9.71±1.15vs.12.92±1.64, p=0.006;8.17±0.79 vs.11.17±1.45,p=0.002),和野生型小鼠对照组间却没有统计学差异(分别是p=0.388；p=0.285)；还有伴随着小鼠结肠CD4+淋巴细胞数目的减低(14.00±2.94 vs.3.50±1.29,p0.001).IL-10基因敲除小鼠无干预措施组和喂食丁酸盐的IL-10基因敲除小鼠实验组的粪便中的乙酸、丙酸和丁酸的含量明显比野生型小鼠空白对照组的含量显著增加(分别是乙酸：3.48±0.27 vs.0.76±0.16 ug/g,p0.001以及2.72±0.42 vs. 0.76±0.16 ug/mg,p0.001；丙酸：0.78±0.18 vs.0.25±0.04 ug/mg,p=0.001 以及0.75±0.17 vs.0.25±0.04 ug/mg,p=0.001；丁酸1.57±0.60 vs. 0.18 ±0.06 ug/mg,p=0.044和1.26±0.46 vs.0.18±0.06 ug/mg,p=0.042).而IL-10基因敲除小鼠无干预措施组粪便中的短链脂肪酸仅乙酸含量与喂食丁酸盐的IL-10基因敲除小鼠实验组有统计学差异(3.48±0.27 vs.2.72±0.42 ug/mg, p=0.006),而丙酸及丁酸的含量却没有统计学差异(分别是p=0.800和p=0.792)。菌群分析发现在门的水平上,在喂食丁酸盐的IL-10基因敲除小鼠实验组中厚壁菌门的细菌的含量比IL-10基因敲除小鼠无干预措施组却有了明显地增加(32.86±1.47 vs.12.68±10.62%;p=0.012),拟杆菌门细菌的含量下降(62.76±2.38 vs.81.07±13.51%,p=0.046).在科的水平上,喂食丁酸盐后的IL-10基因敲除小鼠实验组的乳酸杆菌科及Erysipelotrichaceae细菌含量却升高了,虽然无统计学差异(分别是6.69±6.75 vs.0.98±0.42%,p=0.132和12.87±11.27 vs.2.38±2.65%,p=0.155)。在属的水平上,喂食丁酸盐后的IL-10基因敲除小鼠实验组的普雷沃什菌属的细菌含量却比无干预措施组小鼠的含量明显降低了,虽然无统计学差异(18.79±16.18 vs.31.68±19.23%,p=0.219)。另外,喂食丁酸盐后的IL-10基因敲除小鼠实验组的物种丰富度比IL-10基因敲除小鼠无干预措施组高(shannon指数：3.22±0.29 vs.2.91±0.74,p=441; Simpson指数：0.09±0.02 vs. 0.17±0.11,p=0.175),虽然均无统计学差异。最后,IL-10基因敲除小鼠无干预措施组粪便中IgA包裹性细菌的含量比野生型小鼠和喂食丁酸盐后的IL-10基因敲除小鼠实验组的含量均明显升高(分别是80.5±12.10 vs .54.8±2.12%,p=0.001和80.5±12.10 vs.44.7±0.92%,p0.001),而野生型小鼠和喂食丁酸盐后的IL-10基因敲除小鼠的粪便中IgA包裹性细菌的含量无统计学差异。研究结论：IL-10基因敲除小鼠喂食丁酸盐后小鼠结肠炎症减轻,炎症因子IL-6和TNF-a的表达下降,同时减少肠道SCFAs的丢失,改善肠道菌群内菌群紊乱,丰富肠道菌群的生物多样性,降低肠腔内致肠炎的IgA包裹性细菌的含量。丁酸盐减少肠腔内致肠炎的IgA包裹性细菌含量和改善菌群结构,这可能是丁酸盐治疗IBD肠道炎症的作用机制。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574

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