腺病毒介导的MMP-8截短体融合HGF双突变体1K1促进肝细胞增殖及缓解肝硬化的体内外研究

发布时间：2017-12-09 09:23

  本文关键词：腺病毒介导的MMP-8截短体融合HGF双突变体1K1促进肝细胞增殖及缓解肝硬化的体内外研究

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【摘要】：背景：肝纤维化是绝大多数类型的慢性肝脏疾病的一个显著特征,是肝脏对各种慢性损伤产生的一种保护性的反应,是一种可逆性的瘢痕形成反应。在许多患者,肝硬化的病因尚不明确。可能的诱因很多,包括：病毒、自身免疫、药物、酒精、胆汁淤积和代谢等种种因素,其临床表现也变化多端,从没有临床表现仅依靠相关检查确定,到后期的肝功能衰竭,均为肝硬化临床表现的范畴。肝硬化的病人,具有较高的死亡率,而且接近70%的死亡病人是由肝脏疾病引起的。对于肝纤维化治疗方法的研究,大部分是基于其发病机理进行的。综合起来,其研究主要可以分为3个方面：促进肝细胞的增殖、抑制肝星状细胞的功能或者活性、降解肝纤维化过程中集聚的胶原。在其他的治疗方面,肝移植和诱导肝纤维化的原发病的控制也很重要。目的：本研究中,我们通过蛋白质工程的原理构建了一个融合蛋白CMMP8-1K1,应用腺病毒载体来提高其感染效率和增加在肝脏中的分布,通过这种方式将其应用到70%肝切除和肝硬化小鼠模型中,拟通过这种基因治疗的方式观察融合蛋白对肝硬化的治疗／缓解作用,并根据此实验提供的信息,在体外细胞水平上对融合蛋白在肝硬化治疗／缓解中的作用机制进行探讨,为肝硬化的治疗提供一个新的思路。方法：1,通过化学合成的方式,合成融合蛋白的基因序列,并将其构建到腺病毒载体中,通过病毒包装获得含有目的基因的腺病毒；2,将含有目的基因的腺病毒／对照腺病毒通过尾静脉注射的方式注射入70%肝切除和肝硬化模型小鼠中,通过观察其在小鼠中的分布及通过对小鼠肝组织、血清及其他相关组织的染色、免疫印迹、ELISA等方法检测融合蛋白对70%肝切除和肝硬化小鼠的作用；3,通过体内实验的研究,我们在体外的HL-7702细胞、LX2细胞、Ⅰ型胶原中对融合蛋白缓解肝硬化的机制进行探讨,通过检测细胞增殖、凋亡、免疫印迹、PAGE等方法探讨融合蛋白缓解肝硬化的机制。结果：1,通过化学合成的方式,合成融合蛋白的基因序列,并将其构建到腺病毒载体中,通过病毒包装获得含有目的基因的腺病毒,测序结果正确,病毒滴度满足实验需求。2,将含有目的基因的腺病毒／对照腺病毒通过尾静脉注射的方式注射入70%肝切除的小鼠中,结果显示融合蛋白具有促进肝细胞增殖的作用,并且还可以保护肝功能；3,将含有目的基因的腺病毒／对照腺病毒通过尾静脉注射的方式注射入肝硬化小鼠模型,在形态学上,融合蛋白可以促进肝硬化的缓解,使α-SMA、TGF-β1的表达减少,胶原沉积减少；在功能上,同样可以保护肝功能,促进PCNA的表达；4,在体外,融合蛋白可以促进肝细胞株HL-7702的增殖,使PCNA表达增加,并且促进c-Met, Mek, erk的磷酸化增加；对肝星状细胞株LX2,融合蛋白可以抑制TIMP-1、α-SMA, TGF-β1. COLI/III的表达,并且增加5-FU诱导的LX2细胞凋亡；5,不仅如此,融合蛋白对可溶性Ⅰ型胶原在体外也具有降解作用,可以将120KD的Ⅰ型胶原降解为85KD和35KD的两种片段。结论：1,融合蛋白通过腺病毒注射的方式具有肝脏富集作用,并且可以促进肝脏增生、缓解肝硬化、保护肝功能；2,融合蛋白在体外可以通过促进c-Met, Mek, erk的磷酸化增加促进肝细胞增殖；并且减少肝星状细胞TIMP-1、α-SMA、TGF-β1、COL I/III的表达,并且增加5-FU诱导的LX2细胞凋亡；；3,融合蛋白对可溶性Ⅰ型胶原在体外也具有降解作用,可以将120KD的Ⅰ型胶原降解为85KD和35KD的两种片段。因此,融合蛋白在体外具有直接的胶原降解作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2

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本文编号：1269888