PNPLA3基因I148M多态性在非酒精性脂肪性肝纤维化中的机制研究

发布时间：2017-12-10 05:11

  本文关键词：PNPLA3基因I148M多态性在非酒精性脂肪性肝纤维化中的机制研究

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【摘要】：目的：在动物和细胞水平上探究PNPLA31148M基因多态性对Hedgehog (Hh)信号通路表达的影响,从而揭示PNPLA3 I148M基因多态性在非酒精性脂肪性肝纤维化中作用机制。方法：采用显微注射法构建了野生型纯合子(PNPLA3+/+)、杂合子(PNPLA3148M/+)、突变型纯合子(PNPLA3148M/M)三种转基因小鼠模型,在相同环境下,采用正常饮食、饮水饲养16周后,将小鼠在乙醚麻醉后迅速解剖,从心脏采取血液标本,检测血清中的TG、TC、ALT、AST的水平,获取小鼠新鲜的肝脏组织标本,采用荧光定量PCR的检测Hh信号通路基因以及与细胞增殖凋亡相关基因的表达,采用western blot在蛋白水平上对上述基因的表达进行验证。在细胞实验方面,运用双酶切的方法合成PNPLA3 I148M野生型及突变型的基因序列和慢病毒载体序列,将目的基因序列和载体序列进行连接,合成携带目的基因的载体质粒并对其纯化扩增及转染293T细胞,从而获得高滴度携带PNPLA3不同基因型的慢病毒；采用慢病毒转染的方法转染HSC-T6细胞,利用嘌呤霉素对转染的HSC-T6细胞株进行筛选,构建能够稳定表达PNPLA3 I148M野生型和突变型基因细胞系,在此基础上,分别检测过表达PNPLA3 I148M野生型和突变型基因的HSC-T6细胞内Hh信号通路及与细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,并采用Western blot进行蛋白水平上的验证。定量资料以“均数±标准差”进行表述,采用独立样本t检验对定量资料进行统计学分析；检验标准设定为P0.05。结果：(1)与PNPLA3+/+小鼠相比,PNPLA3148M/M小鼠血清中ALT水平高于PNPLA3+/+小鼠,结果有统计学意义。(2)与PNPLA3+/+小鼠相比,PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝脏组织内shh、patched、smo、gli-1等基因的表达明显上调,差异具有统计学意义。(3)与PNPLA3+/+小鼠相比,我们发现PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝脏组织内bcl-2, PDGF和TGFβ1等基因的表达明显增高,差异具有统计学意义。(4)成功组装了携带PNPLA3 I148M野生型和突变型基因的慢病毒,并成功感染了HSC-T6细胞,采用倒置荧光显微镜观察,绿色荧光阳性率达到85%,采用嘌呤霉素筛选后,阳性率达到95%以上。采用Western blot验证野生型组和突变型组细胞内PNPLA3蛋白较空载体对照组细胞表达增加,证实过表达PNPLA3 I148M野生型和突变型基因的HSC-T6细胞株构建成功。(5)PNPLA3 I148M突变基因过表达的HSC-T6细胞系内shh、patched、smo、gli-1等基因的相对表达量明显高于野生型细胞组,差异具有统计学意义。(6)与PNPLA3 I148M野生型细胞相比,突变型细胞内bcl-2, PDGF和TGFβ1表达明显上调,差异具有统计学意义。结论：PNPLA3 I148M基因突变可能通过促进Hh信号通路的激活,引起肝星状细胞的增殖和活化,在非酒精性脂肪性肝纤维化的发生中发挥着重要的作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575

【参考文献】

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本文编号：1273240