HCV核心蛋白下调E-cadherin表达的分子机制研究

发布时间：2018-01-03 00:07

本文关键词：HCV核心蛋白下调E-cadherin表达的分子机制研究　出处：《重庆医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:据统计,原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。非酒精性脂肪肝病、肝炎病毒的慢性感染、过量摄入酒精、黄曲霉素以及自身免疫性肝病等都是引起HCC的重要原因,其中丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是导致HCC发生的其中一个重要原因。根据世界卫生组织统计,目前全球HCV感染率大约3%,并且每年因为HCV感染导致肝细胞发生慢性炎症、肝硬化,甚至是肝癌的患者数正以1%-7%的速度增加。因此,HCV慢性感染已经成为严重威胁人类健康的社会公共卫生问题。HCV病毒主要可以分为6种基因型,80多种亚型,其中我国多发为1b型和6型,研究表明,HCV 1b型感染患者的肝细胞损伤程度较其他基因型感染者更加严重,并且发展为肝硬化,甚至是肝癌的几率更高。所以,开展有关HCV感染引起HCC相关机制的研究具有极其重要的意义。1989年,Choo QL等首次鉴定出HCV病毒,它是除乙型、甲型肝炎病毒以外引起慢性肝炎的主要病原体。HCV属于黄病毒科嗜肝病毒,为基因组全长9.6kb的单股正链RNA病毒,在各种宿主细胞信号肽酶以及病毒蛋白酶的共同作用下,可以编码成至少10种病毒蛋白,从氨基端到羧基端依次包括3种结构蛋白(Core、E1、E2)以及P7、NS2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b7种非结构蛋白。其中hcv核心蛋白(hcvcore)在病毒与宿主细胞相互作用中扮演了非常重要的角色,具有直接的致癌效应,其诱导的细胞信号转导和转录因子调控异常参与了hcv相关肝癌的发生和恶性转移过程,但具体机制不明。snail是转录因子snail超家族的重要成员,研究表明snail是上皮细胞向间质转化现象中的关键诱导分子,对干细胞特性的维持、细胞生存和凋亡以及免疫调节起着重要作用。snail基因总共含有264个氨基酸,主要包含3个功能结构域,有证据表明,snail基因羧基端的锌指结构区可以特异性识别含有5’-caggtg-3’碱基序列的e-box结构,抑制基因的表达,这一机制被认为是snail抑制e-cadherin表达,促进细胞发生emt转变的关键。1980年,人们首次发现一种具有丝氨酸/苏氨酸活性的激酶—糖原合成酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3,gsk-3),是参与调控糖原合成的关键酶之一。gsk-3家族分为α和β两个亚型,其中gsk-3β是wnt/β-catenin和pi3k/akt信号通路的关键组成部分,参与调节细胞黏附、分化、增殖与凋亡等过程,在肿瘤细胞的信号转导过程中发挥了重要作用。研究发现,hepg2肝癌细胞株中的e-cadherin表达水平明显下降,而胞浆内p-gsk3β(gsk-3β失活)的水平却显著上升,说明gsk-3β可能参与调控e-cadherin转录。本课题组前期实验研究发现:(1)在hcv核心蛋白过表达的肝癌细胞和肝前体细胞、hcv感染的huh7.5.1细胞迁移和侵袭能力明显增强,通过对emt分子标志物的检测发现:hcv核心蛋白下调e-cadherin表达,上调vimentin表达,并且外源表达e-cadherin可以部分逆转core诱导的emt;(2)hcvcore抑制e-cadherin启动子活性,并与snail的结合位点e-box密切相关;(3)信号通路报告质粒筛查实验发现,过表达hcvcore的肝癌细胞pi3k/akt信号通路活化,p-akt和p-gsk3β的表达水平上调,gsk-3β活性受到抑制。根据前期实验发现core对e-cadherin的调控与snail作用于e-cadherin的位点相关,因此我们猜想hcvcore有无可能直接与转录因子snail作用,负性调控e-cadherin表达,并对两者的相互作用进行了比较深入的分析;同时考虑到snail蛋白容易降解,且与gsk-3β活性相关,我们推测hcvcore是否可能直接抑制gsk-3β活性,减少其对转录因子snail的降解,促进snail的稳定性,进而调控e-cadherin的表达?本课题将对深入了解hcv参与细胞信号转导、emt进程以及肝癌转移的分子机制具有重要的意义,同时也为开发hcv治疗药物靶标奠定分子基础。方法:本研究拟通过hcvcore过表达细胞模型以及hcv体外细胞复制模型,采用transwell、westernblot、sirna技术观察hcvcore对e-cadherin表达的影响;并进一步通过染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)、gst-pulldown、免疫荧光(immunofluorescence,if)等实验技术,深入探索hcv核心蛋白与snail作用于e-cadherin表达的相关性,在转录水平深入分析core能否与snail或其他组蛋白修饰酶形成复合物,共同调控e-cadherin的表达;同时还将研究hcvcore能否促进gsk-3β的转位,下调gsk-3β活性,参与细胞emt进程。结果:采用wakita的实验方案,我们成功转录获得了jfh-1rna,将其转染huh7.5.1细胞后,检测到了hcvcore的稳定表达;收集转染后第3天的细胞上清,经浓缩、过滤后感染hlcz01细胞8天,检测到细胞内hcvrna含量明显上升,同时免疫荧光实验观察到core蛋白的表达。在过表达hcv核心蛋白的的sk-hep1细胞中,我们发现hcvcore明显增强细胞迁移能力,而外源性回复e-cadherin表达后,细胞的emt转化过程部分受到阻断;在过表达核心蛋白的huh7细胞中,沉默内源性e-cadheirn表达后,细胞的迁移、侵袭能力进一步增强。同时我们在jfh-1转染的huh7.5.1细胞模型以及jfh-1感染的hlcz01细胞模型中,观察到hcvcore能够明显下调e-cadherin表达。在转染jfh-1rna的huh7.5.1细胞中,通过免疫荧光实验发现core蛋白可定位于细胞核内,且与转录因子snail存在共定位现象;同时采用免疫共沉淀、gst-pulldown等实验进一步发现hcvcore主要与snail基因羧基端相结合,从而发挥对e-cadherin基因的负性调控作用。同时snail可以招募hdacs增强core结合于cdh1启动子区,形成复合物,共同调控e-cadherin表达。另外,在转染jfh-1rna的huh7.5.1细胞中,我们发现hcvcore能够促进gsk-3β的转位,促进其磷酸化,从而下调gsk-3β酶的活性,实现细胞emt转变过程。结论:我们发现hcv核心蛋白可以促进gsk-3β的转位,下调其酶活性;通过chip、ip实验证实hcvcore与snailc-端153-264位氨基酸编码蛋白结合,募集HDACs形成抑制性复合物,共同抑制E-cadherin表达,促进细胞EMT进程。揭示了HCV core对肝癌发生、发展的促进作用与转录因子Snail密切相关,为阐明HCV感染导致的相关肝癌的发生发展机制提供了新的理论依据,同时也为HCV感染而导致的肝癌的靶向治疗奠定了极其重要的理论基础。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7;R512.63

【参考文献】