HEV对沙鼠和兔脑脊髓损伤作用及其机制

发布时间：2018-03-11 06:17

本文选题：HEV　切入点：脑　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目前关于HEV感染引发神经功能障碍比如脑炎、脑膜炎、脊髓炎和格林巴利综合症等的报道越来越多,为揭示戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)感染引发中枢神经功能障碍的致病机制,本研究利用猪源四型HEV感染沙鼠及兔动物模型,采用RT-nPCR、real-timeqPCR、免疫组织化学、组织病理学和超微结构病理学、Transwell小室试验、western-blot等方法,对HEV在中枢神经组织中复制、抗原分布和HEV感染引发脑和脊髓组织病理损伤以及相关机制进行观察研究;同时结合HEV感染人脑微血管内皮细胞体外实验,对HEV穿过血脑屏障(Blood-brain-barrier,BBB)以及引发血脑屏障结构损伤的机制进行了深入观察分析。研究结果如下:1.通过腹腔注射途径给沙鼠接种HEV后,在急性感染期可在脑和脊髓组织中检测到HEV正链及其复制中间产物负链RNA;通过real-time qPCR检测到脊髓中的病毒载量高于脑组织;免疫组织化学观察结果发现HEVORF2抗原阳性信号主要分布于血管周围区域、脉络丛区、室管膜上皮以及一些神经元和神经胶质细胞胞浆内;组织病理学观察见脑和脊髓组织中血管周围、脉络丛区以及室管膜下方有淋巴细胞浸润,小胶质细胞弥漫性增生,散在神经元变性坏死变化;超微病理学观察结果显示脑及脊髓细胞胞浆基质减少,细胞器数量减少,线粒体肿胀变圆,线粒体嵴断裂、数量减少,神经纤维髓鞘变性,毛细血管内皮细胞肿胀,血管壁结构紊乱层次不清,内皮细胞之间连接复合物结构缺失等。2.通过腹腔注射和灌喂两种途径给兔感染HEV后,仅在腹腔注射组中枢神经组织中检测到HEV抗原,表明与腹腔注射相比,粪口途径传播不易引起中枢神经系统感染HEV;免疫组织化学和组织病理学观察HEVORF2蛋白阳性信号分布和脑、脊髓的组织病理损伤以及荧光定量PCR结果与HEV感染沙鼠的结果基本一致。3.HEV感染沙鼠试验及HEV接种脑微血管内皮细胞体外试验均证实,HEV感染导致了脑、脊髓微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白的表达量显著减少(P0.05或P0.01),以致脑、脊髓血管内皮的通透性增加,HEV可以穿过血脑屏障侵入脑、脊髓实质中。HEV接种脑微血管内皮细胞Transwell小室实验结果显示,血管内皮细胞对于HEV的内吞及转胞吞作用可以被网格蛋白抑制剂所抑制。并且western-blot分析显示接种HEV的脑微血管内皮细胞中ATP5A1表达量减少而NOX4表达量增加。4.通过免疫组织化学方法检测到感染HEV沙鼠脑、脊髓组织中小胶质细胞和星形胶质细胞增生,P物质、TNF-α、IL-1β和VIP表达量明显增高(P0.05或P0.01);此外,通过western-blot方法检测出感染HEV沙鼠的脑组织中线粒体凋亡通路相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3表达量也明显增多。这些成分的变化均参与了 HEV感染造成脑和脊髓组织损伤的过程。以上研究结果显示,HEV可能通过网格蛋白介导的内吞作用进入血管内皮细胞,影响ATP合成以及引发内皮细胞氧化应激,导致血脑屏障损伤,并通过跨细胞转运以及细胞旁途径穿过血脑屏障结构从而感染中枢神经实质组织,引起小胶质细胞和星形胶质细胞活化增殖,释放促炎因子TNF-α和IL-1β等,引发脑和脊髓组织炎症反应以及细胞线粒体凋亡途径激活,导致脑和脊髓组织损伤。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R512.6

【参考文献】