NLRP3炎症体在肝细胞内表达和功能的初步研究

发布时间：2018-03-13 20:33

本文选题：肝实质细胞　切入点：NLRP3炎症体　出处：《第三军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：炎症体（inflammasomes）是存在于细胞内的一类多蛋白复合物，作为机体对内外源危险信号的应答平台，通过促进IL-18和IL-1β等效应细胞因子活化，或通过诱导细胞pyroptosis（一种程序化、炎性的细胞死亡方式），启动炎症应答，促进机体固有免疫应答和后天获得性的免疫应答，以达到防御感染、维护机体内稳态的目的。启动炎症体形成的感受器蛋白主要包括有两大家族：NLR家族（NOD样蛋白家族）和ALR（AIM2样蛋白家族）家族，它们在病原菌相关模式分子（PAMPs）和组织损伤相关模式分子（DAMPs）刺激下，招募接头蛋白和pro-caspase-1，组装成为约700kD的巨分子复合物——炎症体，聚集在一起的pro-caspase-1通过自体切割方式导致caspase-1活化，活化的caspase-1进一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18，生成活性IL-1β和IL-18，并促进它们分泌到细胞外来发挥各种炎症效应；或通过诱导细胞死亡（pyroptosis）来启动炎症。 NLR（NOD-like receptor）家族是启动的炎症体形成的主要感受器蛋白，NLR家族成员包括NLRP1、 NLRP3、NLRC4和NLRP6。在分子结构特点上，NLR家族包含：核苷酸连接区域和寡聚化结构域（NACHT），位于两侧的通常分别是C-端富含亮氨酸的重复序列（LRRs）和N-端招募caspase的结构域（CARD）或热蛋白结构域（PYD）。目前认为LRRs在配体识别和蛋白质自身调节方面发挥作用，，而CARD功能域和PYD功能域，可通过调控同型蛋白质相互作用介导下游信号。NACHT结构域是唯一所有NLR家族成员所共有的结构域，可通过依赖ATP的寡聚化作用激活信号复合体。NLRP3没有CARD功能域，因此，需要先通过它的PYD功能域招募adaptor蛋白ASC，再通过ASC的CARD功能域征募caspase-1酶原来活化caspase-1。在活化信号上，NLR家族拥有众多的活化信号，其中，NLRP3的活化信号最为广泛多样，NLRP3炎症体可以在众多病原体（细菌、病毒、真菌）或非病原体来源刺激物（比如ATP、尿酸、硅晶体、淀粉样蛋白β）刺激下活化，参与炎症相关疾病的发生发展，但NLRP3蛋白质分子被认为不可能通过物理作用结合结构如此多样的信号分子。因此，很可能通过某些共同的中间途径引起NLRP3炎症体的活化，目前已经提出了三条活化途径，包括：（1）NLRP3活化剂ATP可以通过泛连接蛋白半通道引起P2X7-依赖的细胞膜孔的形成，因此导致细胞外的NLRP3激活物通过细胞膜孔进入细胞质直接活化NLRP3；（2）内吞入细胞的微粒和晶状体，它们的物理特性损伤溶酶体，引起溶酶体内容物（例如，组织蛋白酶B）释放到胞浆活化NLRP3炎症体；（3）包括ATP、微粒、晶体等在内的各种DAMPs和PAMPs都可以引起细胞内活性氧ROS产生，并通过依赖活性氧ROS途径来活化NLRP3炎症体。近来有证据进一步显示，也许这3个不同的途径都是通过钾离子外流的增加这一共同途径，导致NLRP3炎症体活化。目前已经有部分研究涉及到了炎症体功能失调与各种临床疾病的关系，证实NLRP3炎症体在抗病毒、心血管疾病等众多疾病的发生发展中扮演着重要角色。研究证实炎症体可参与机体抗菌固有免疫应答，甲型流感病毒是NLRP3的间接活化剂。感染甲型流感病毒时，机体可通过依赖Toll样受体7（TLR7，Toll-like receptor7）识别病毒RNA，并引起NLRP3炎症体组分转录水平升高。随后，活化的病毒M2离子通道蛋白引起反面高尔基网（即分泌面高尔基网络）PH中和作用，进一步引起钾离子外流和活性氧ROS形成，促进NLRP3炎症体活化。如我们所知，胆固醇沉积于动脉血管是动脉粥样硬化特异性的病征，胆固醇晶体通过破坏吞噬溶酶体稳定性方式，活化弱氧化修饰低密度脂蛋白（mmLDL，minimal modified low density lipoprotein）预激的小鼠和人巨噬细胞内NLRP3炎症体。不仅如此，研究者发现，通过骨髓再造（使缺乏NLRP3，ASC或IL-1α/β），明显的抑制了低密度脂蛋白LDL受体基因敲除小鼠（易患动脉粥样硬化）动脉粥样硬化的发展，提示造血系统NLRP3炎症体活化和IL-1分泌在动脉粥样硬化疾病早期阶段扮演重要的角色。慢性乙型肝炎是由嗜肝病毒HBV感染肝细胞导致的慢性肝脏损伤。全球超过50%肝癌是继发于慢性乙型肝炎，虽然临床抗病毒治疗使慢性乙型肝炎向肝癌的转归得到部分控制，但仍然有约一半的病人难以完全控制肝脏持续的炎症性损伤，以及慢性肝硬化转归的结局。已经有多篇文献报道，IL-1β可能在在肝纤维化过程中具有重要的促进作用，由于IL-1β同时也是炎症体活化的重要产物，我们高度怀疑炎症体功能失调可能在慢性乙型肝炎的进展中具有重要作用。介于NLRP3炎症体有着广泛多样的活化信号，并且也证实在机体其他慢性炎性疾病中具有重要作用，NLRP3炎症体功能失调参与慢性乙型肝炎的疾病进展的可能最大。另外，越来越多的证据表明，有许多非骨髓来源细胞也表达的NLRP3炎症体，比如脂肪细胞、心肌细胞/心肌成纤维细胞等，并在糖尿病、心肌梗死等相关疾病发生发展进程中扮演重要角色。肝脏主要由组成细胞是实质细胞，占到了肝脏体积的80%，而包括肝星形细胞（HSC）、枯否细胞（KC）和肝窦内皮细胞（SEC）等在内的肝脏非实质细胞仅占肝体积的6.5%。因此，我们拟通过了解NLRP3炎症体各组分在慢性乙肝病人肝组织和正常肝细胞中的表达和功能，来初步判断NLRP3炎症体是否有可能参与慢性乙肝的发病，为进一步深入研究NLRP3炎症体在慢性乙型肝炎中的功能奠定基础。综上，本课题研究分为两个部分，第一部分为检测NLRP3炎症体各组分在原位肝组织和肝细胞株的表达，通过细胞免疫组化、Western blot等确定人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2细胞内均有NLRP3炎症体及相关部件的表达（以Thp-1细胞株作为阳性对照），也发现NLRP3、caspase-1、IL-1β在乙型肝炎肝组织与正常肝组织切片均有表达，乙型肝炎病人中NLRP3炎症体表达明确，但在正常肝组织切片中，表达较弱。第二部分研究NLRP3炎症体在肝细胞中的功能，主要通过相应的危险信号刺激，检测肝实质细胞内NLRP3炎症体是否具有相应的炎症响应功能。结果显示在内源性危险信号ATP的刺激下，肝细胞株HepG2/L02的IL-1β分泌明显增高，肝癌细胞株HepG2表现出比胎肝细胞株L02更高的IL-1β分泌能力，但肝细胞总体上的炎症响应能力都弱于单核-巨噬细胞，在1.5×106接种，1.5ml体系培养，5Mm ATP刺激6h(100ng/ml LPS预激12h)的同等情况下，Thp-1分泌的IL-1β为500-1000pg/ml，HepG2为300-600pg/ml，L02仅为20-50pg/ml，但考虑到肝脏中肝细胞的总体数量，因此，在慢性乙型肝炎疾病进程中，肝细胞来源的炎症应答能力不可小觑。总之，本研究旨在明确肝脏实质细胞NLRP3炎症体的表达和炎症应答能力，为进一步探究NLRP3炎症体在CHB疾病进程中发挥的作用奠定基础或提供理论线索。一、实验方法： 1）第一部分：NLRP3炎症体在肝细胞中的表达 1．通过细胞免疫组化和细胞免疫荧光法，检测正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2细胞内NLRP3炎症体及相关部件的表达情况，并以单核-巨噬细胞株Thp-1作为阳性对照； 2．通过免疫组化或免疫荧光检测乙型肝炎肝组织与正常肝组织NLRP3炎症体、caspase-1、IL-1β的表达（以扁桃体组织作为阳性对照），以明确NLRP3炎症体及炎症体相关部件在乙型肝炎肝组织和正常肝组织中的原位表达情况和表达差异； 3．通过Western Blot检测胎肝细胞株L02、肝癌细胞株HepG2和肝组织中内NLRP3炎症体的表达，以明确NLRP3炎症体在肝实质细胞、肝组织内的蛋白分子表达情况，并以GAPDH表达量为内参，利用Quanity One软件半定量分析NLRP3炎症体在乙型肝炎肝组织和正常肝组织中的蛋白分子表达水平的差异； 2）第二部分：NLRP3炎症体在肝细胞内的功能 1．通过RT-PCR、RT-real-time PCR检测LPS炎性刺激对胎肝细胞株L02和肝癌细胞株HepG2细胞内caspase-1、IL-1β基因表达的影响，以了解炎性刺激对肝细胞内炎症体相关部件基因表达水平的影响； 2．ATP作为NLRP3炎症体的经典激活剂，LPS、LPS+ATP分组刺激肝细胞株L02/HepG2，并通过Western Blot检测L02/HepG2胞内caspase-1活化片段；通过ELISA检测在LPS、LPS/ATP或LPS/ATP/Y-VAD-fmk刺激下，肝细胞株L02/HepG2和单核巨噬细胞株Thp-1细胞培养上清中IL-1β、IL-18分泌情况，以明确正常肝细胞NLRP3炎症体是否为功能性表达，能否对内源性危险信号具有明确的炎症响应。二、实验结果： 1．免疫组化和免疫荧光的结果显示，在HepG2/L02肝细胞内检测到有NLRP3和capsape-1表达不明显，LPS刺激24h可促进NLRP3炎症体在HepG2/L02中的表达；在正常肝组织内NLRP3、caspase-1、IL-1β虽然有表达，但表达水平很低，而乙型肝炎肝组织NLRP3炎症体的表达较正常肝组织显著增高，免疫组化未检测到caspase-3在乙肝肝组织中表达； 2．RT-PCR、RT-real-time PCR结果显示，LPS刺激18h左右，L02、HepG2肝细胞内caspase-1、IL-1β的mRNA转录水平均增高；而LPS短时的刺激在4h左右稍微增高，说明这两株肝实质细胞对LPS刺激的应答可能不够敏感，需要较长时间刺激才能够上调炎症体的相关组分的表达； 3．Western Blot结果显示，L02肝细胞、HepG2肝细胞和肝组织内均表达NLRP3炎症体，其中Quanity One结果分析显示乙肝肝组织中NLRP3炎症体的表达水平较正常肝组织蛋白表达水平明显升高；不仅如此，内源性危险信号ATP刺激活化L02/HepG2胎肝细胞株胞内NLRP3炎症体，活化的炎症体进一步招募并切割pro-caspase-1，使成生成更多caspase-1活性P10亚基； 4．ELISA结果显示，内源性危险信号ATP显著的促进L02胎肝细胞株IL-1β和IL-18分泌，不仅如此，caspase-1特异性阻断剂Y-VAD-fmk可抑制ATP介导的L02胎肝细胞株IL-1β和IL-18分泌，因此ATP介导的L02胎肝细胞株IL-1β和IL-18分泌依赖肝细胞内caspase-1的活化。三、结论： 1．L02肝细胞、HepG2肝细胞和肝组织中均表达有NLRP3炎症体，并且，肝细胞内表达的NLRP3炎症体可识别内源性危险信号ATP活化caspase-1，分泌IL-1β和IL-18，说明了肝实质细胞内表达的NLRP3炎症体具有识别危险信号启动炎症应答的能力。 2.与骨髓来源的Thp-1细胞相比，肝实质细胞的炎症响应能力较弱，在同等程度的危险信号刺激下，L02胎肝细胞株IL-1β的分泌量仅是Thp-1的1/50-1/10，但HepG2肝癌细胞株可达到Thp-1的1/3-1/2，再考虑到肝组织局部的肝细胞和巨噬细胞、树突状细胞等细胞的比例，我们认为肝细胞内的NLRP3炎症体具有参与慢性乙型肝炎炎性损伤的可能，但还需要进一步的研究来提供证据。 3．慢性乙型肝炎肝组织细胞内NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达较正常肝组织显著增高，说明肝细胞内NLRP3炎症体可能参与慢性乙型肝炎的疾病进程。综上，本课题对肝脏实质细胞NLRP3炎症体的表达和炎症应答能力进行了初步研究，为进一步探究NLRP3炎症体在CHB疾病进程中发挥的作用奠定基础或提供理论线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.6

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