同种异体山羊嵌合体肝脏模型的建立

发布时间：2018-03-22 07:05

本文选题：嵌合体肝脏　切入点：山羊　出处：《昆明医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[目的]建立同种异体山羊嵌合体肝脏,为研究间充质干细胞体内生存演变规律、免疫耐受形成机制和开展肝脏疾病研究提供实验动物模型。[方法]1.山羊骨髓间充质干细胞(BMMSC)的分离、鉴定:无菌条件下采集1月龄的雄性羔羊骨髓0.5-lml,通过全骨髓贴壁培养法分离细胞,采用镜检方法观察细胞形态特征、流式分析方法鉴定细胞免疫表型、体外诱导方法鉴定细胞分化潜能。2.山羊BMMSC的标记:采用携带绿色荧光蛋白基因(GFP)的慢病毒与BMMSC共培养的方法转染标记BMMSC,测定慢病毒的最佳剂量。3.胎肝内定位注射GFP标记的BMMSC:在B超辅助下建立胎羊肝脏内定位注射GFP标记的BMMSC的技术方法,观察移植后受体母羊的生活状态。4.山羊嵌合体肝脏模型的鉴定:待孕羊分娩后50天,通过手术方法切取新生羔羊部分肝脏组织做以下鉴定分析:(1)GFP阳性细胞观察:切取羔羊少许肝脏制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察肝组织中GFP阳性细胞的存在和分布;(2)HE染色分析:将冰冻切片置于福尔马林液中固定5min,进行HE染色后,在显微镜下观察GFP阳性细胞分布及病理组织学结构;(3)SRY基因表达鉴定:采集新生羔羊少许肝脏组织,分别提取DNA进行PCR扩增以鉴定SRY基因的表达。(4)GFP阳性细胞比例测定:切取羔羊少许肝脏剪碎后,用新鲜胶原蛋白酶消化,制成肝脏单细胞悬液,应用流式细胞仪检测分析GFP阳性细胞比例;[结果]1.采用全骨髓贴壁培养法,使用含10%FBS的DMEM/F12悬浮漂洗过的骨髓细胞并静置培养4-5天后,就可在镜下观察到贴壁生长的长梭形细胞或细胞集落,8-12天后可以在镜下观察到成片密集排列呈旋涡状贴壁生长的成纤维细胞样细胞。取第3代细胞用流式细胞仪检测,结果为这些细胞高表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105,低表达或者不表达CD3。并可被诱导向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化,由此判断所获细胞为BMMSC。2.按0、10、100的MOI加入慢病毒与山羊BMMSC共培养,3天后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光出现,表明已经成功转染了 GFP,且MOI为100的转染组GFP表达明显较多,即绿色荧光亮度较强,MOI为10的转染组GFP表达较少,MOI为0的对照组没有观察到绿色荧光。将GFP转染的BMMSC进行传代培养,通过流式细胞术检测传代后GFP细胞的表达率,实验结果显示1-4 代细胞 GFP 转染率分别为(42.3±2.25)%、(41.6±2.65)%、(41.4±3.75)%和(38.2±4.75)%,传代四代内GFP表达率无明显差异。3.借助B超探查结束,可以准确诊断母羊是否怀孕、胎儿数量以及发育状态。在B超显像条件下,可观察到怀孕母羊腹中不同孕龄的胎羊胎心有节律性跳动,可以准确确定位于胎心旁边的胎肝位置,而且一次性注射0.5ml(含106-108)BMMSC到2-4月龄胎肝内,体积合适不会导致流产。4.山羊嵌合体肝脏模型的鉴定:(1)冰冻切片观察:荧光显微镜下可观察到注射过细胞的肝脏组织中有绿色荧光分布,有的呈规律的管状结构,而且注射较多间充质干细胞的羔羊肝组织内有更多的GFP阳性的管状结构。(2)HE染色观察:在冰冻切片中GFP阳性细胞所在的同一视野中可以观察到中央静脉以及环绕于其四周的大量肝索、肝血窦等正常肝脏组织学结构,细胞形态正常。GFP阳性细胞已嵌合在肝组织中并演变为肝组织细胞。同样,在冰冻切片中观察到的GFP阳性管状结构,经HE染色观察证实是典型的胆管,有众多柱状上皮细胞密集环绕呈管状结构,细胞核呈深蓝色,胆管周边可观察到典型的汇管区结构,且没有明显的淋巴细胞浸润。这些结果表明胎肝内定位注射的GFP标记的BMMSC在羔羊出生后50天之内没有受到免疫细胞影响,嵌合到羔羊肝脏组织中演变为肝组织细胞或胆管柱状上皮细胞并且形成了胆管结构。(3)SRY基因表达鉴定:采用PCR方法可以在注射过雄性山羊BMMSC分娩产生的新生50天羔羊肝脏组织中检测到SRY基因的表达情况,包括2只雌性新生羔羊,证实新生羔羊肝脏组织中确实存在雄性山羊供体来源的细胞。(4)GFP阳性细胞比例测定:在注射过细胞的出生50天的新生羔羊肝脏组织中,通过流式细胞技术能检测到GFP阳性细胞的存在,最少的有2.25%的GFP细胞存在,最多的有7.23%的GFP细胞存在。[结论]1.采用全骨髓贴壁培养法、用10%FBS-DMEM/F12培养1月龄羔羊骨髓0.5-1ml,可以分离扩增到呈漩涡状密集排列生长的BMMSC;2.采用携带绿色荧光蛋白基因(GFP)的慢病毒与BMMSC共培养的方法可以成功标记间充质干细胞,慢病毒的最佳MOI值为100,标记的细胞传代4代后GFP的表达率不会显著降低;3.在超声引导下,可以实现3月龄的胎山羊肝脏实质区内BMMSC的定位注射,而且一次性定位注射0.5mlBMMSC(含106个-108个)到2-4月龄胎肝内不会导致母羊流产;4.不同月龄的胎肝内定位注射GFP标记的山羊BMMSC,可以形成嵌合体肝脏。在羔羊出生后50天后的肝脏病理组织中可以观察到GFP阳性细胞的存在或演变为柱状上皮细胞并形成的胆管结构。经PCR鉴定可以在新生雌性羔羊肝脏组织中检测到SRY基因的表达,流式细胞技术分析显示注射肝脏中GFP阳性细胞与BMMSC注射量成正比,表明成功建立了同种异体山羊嵌合体肝脏模型。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R-332;R575

【参考文献】