四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤中自噬的作用及其机理研究
本文选题：CCl_4 切入点：急性肝损伤 出处：《河南师范大学》2016年硕士论文
【摘要】：肝脏是机体的重要器官,承担着物质代谢、氨基酸利用、胆汁酸合成与转化、生物合成与转化、氧化保护、解毒等生理功能。许多理、化、生等因素均可损伤肝脏,导致一系列肝脏疾病的发生,如肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等。研究发现,自噬是真核细胞中存在的溶酶体依赖性降解途径,在清除错误折叠或聚集的蛋白质,损坏的细胞器例如过氧化物酶、线粒体和内质网,以及消除细胞内病原体等方面发挥了重要作用。研究表明,自噬在肝脏损伤的过程中起着重要的作用,肝脏的许多功能依赖自噬的发生反应。然而,对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)诱导的急性肝损伤中自噬的作用及调控机制尚不明确。因此本实验以SD大鼠作为研究模型,将它们分为CCl_4诱导的急性肝损伤组与正常对照组。首先,为了观察CCl_4诱导的大鼠急性肝损伤中自噬的动态变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹反应(Western blot)检测肝损伤过程中自噬相关基因和蛋白的表达,免疫荧光方法检测LC3蛋白荧光聚点的积聚现象,之后用MDC染色法观察晚期自噬溶酶体的分布,HE染色观察大鼠急性肝损伤过程中肝脏形态结构变化,油红O染色检测脂肪滴生成情况。实验结果表明,与对照组相比较,LC3B在CCl_4肝损伤后3-6 h的基因表达上调,随后开始逐渐下调;Atg5基因和蛋白的表达变化趋势和LC3B相一致;SQSTM1/p62的表达在急性肝损伤中3-6 h表达量降低,之后逐渐升高。免疫荧光检测发现,正常肝组织的LC3B蛋白呈弥散状态分布,CCl_4诱导的急性肝损伤3h后,细胞核周围有LC3荧光聚集;MDC染色结果指出,正常组肝脏中,MDC荧光表达量较弱,CCl_4肝损伤6 h MDC荧光聚点逐步的增加,荧光信号此时最强,之后逐渐减弱。综上可知,自噬在CCl_4急性肝损伤早期有明显的上调,而且在一定的范围内具有明显的时间-效应关系。为了进一步研究自噬在CCl_4诱导的急性肝损伤过程中的作用,实验采用腹腔注射自噬特异性抑制剂羟氯喹(CQ)进行预处理后,再联合CCl_4诱导大鼠急性肝损伤,通过免疫荧光方法来检测自噬流的变化;HE染色观察CQ联合CCl_4处理后肝组织的形态结构和油红O染色检测脂肪滴生成情况;同时取下腔静脉血进行ALT和AST血清酶活性检测。免疫荧光结果表明,CQ处理组肝脏组织中有少量的LC3蛋白斑点积聚,CQ联合CCl_4处理6 h后,LC3蛋白的荧光聚点现象显著。CQ处理组与对照组相比,HE染色结果发现,正常肝脏形态结构没有显著性的变化,但CQ联合CCl_4组,随着处理时间增加,肝索逐渐消失,肝小叶结构出现紊乱;油红O染色结果表明,CQ联合CCl_4处理组,脂肪滴显著性增多,细胞核碎裂。酶活性检测结果表明,CCl_4肝损伤后ALT和AST酶活性呈现明显的上升趋势,CQ联合CCl_4处理组酶活性增加程度更加明显。最后,免疫荧光进一步检测p21蛋白在肝损伤中的表达变化。自噬受到抑制以后,p21蛋白表达程度增加,说明自噬可以通过抑制p21蛋白的表达来调节肝脏损伤。综上所述得出如下结论,在CCl_4引起的大鼠急性肝损伤早期,自噬水平明显上调,并在一定的时间范围内具有时间-效应关系;自噬在CCl_4处理的大鼠急性肝损伤过程中起到了保护作用;自噬可以通过抑制p21蛋白的表达来调节肝脏损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
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，本文编号：1654920
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