siRNA沉默X盒结合蛋白1对急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的影响

发布时间：2018-03-31 13:17

  本文选题：内质网应激　切入点：未折叠蛋白反应　出处：《河北医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种临床常见的急腹症。临床上大多数患者为自限性的轻度AP(mild acute pancreatitis,MAP);但仍约有20%~30%的患者发病即为或者迁延为重度AP(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP以全身性炎症反应(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)为特点。AP中胰腺的损伤主要表现为腺泡细胞的凋亡和坏死。坏死的细胞大量释放细胞因子及炎性介质,而凋亡是通过形成凋亡小体实现程序性的细胞死亡,避免了细胞内容物的释放。因此,关于如何使诱导发生炎症的腺泡细胞提前凋亡,避免AP病情迁延加重的研究已经成为近年来的热点。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是近年来新发现的一个与细胞凋亡相关的过程。多种理化因素都能够导致内质网稳态失衡,继而引起ERS的发生。未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是ERS的主要应答机制,通过PERK/e IFα、IRE1/XBP1、ATF6三条信号转导途径调控,以使内质网从应激状态恢复至稳态。同时,若ERS过度强力并且持久,受损的细胞也会发生凋亡。X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)能够上调ER分子伴侣的基因表达并加强内质网处理未折叠及错误折叠蛋白的能力,在UPR中的地位最关键。胰腺腺泡细胞对ERS非常易感。ERS及UPR在AP的发病及进展阶段都有参与。敲除XBP1的腺泡细胞将会发生内质网结构缺失及广泛凋亡,而在已经发生AP的腺泡细胞中,对于XBP1的干预作用是否能够在早期即诱导腺泡细胞凋亡,从而避免炎症加重而进展为细胞坏死,目前国内外尚无明确报道。目的:采用RNAi技术对AR42J细胞XBP1基因表达敲低,应用雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖两种方式分别处理AR42J细胞建立不同程度的AP离体细胞模型,探究XBP1蛋白的表达量下调对于AP胰腺腺泡细胞凋亡的影响。方法:随机设计并合成针对大鼠XBP1的小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)3条(XBP1-303、XBP1-684、XBP1-808)及与XBP1基因无同源性无意义si RNA(negative control si RNA)。在lipofectamine 2000介导下转染AR42J细胞,RT-PCR检测XBP1 m RNA表达筛选出沉默效果好的XBP1 si RNA,以此si RNA再次转染AR42J细胞,并于转染后48h分别予以雨蛙素(CAE组)、雨蛙素联合脂多糖(CAE+LPS组)、正常培养液(Negative control组)处理。依据造模后时间分别于4h、8h、24h三个时间点为亚组收集细胞,应用RT-PCR检测各组细胞CHOP m RNA表达水平,Western blot检测各组细胞caspase-12表达水平以及24h亚组GRP78表达水平,Annexin V-FITC/PI双染联合流式细胞术检测造模后24h细胞凋亡及坏死比例。结果:1 XBP1 m RNA表达:XBP1-303转染后的AR42J细胞XBP1 m RNA表达量在各组中最低。2CHOP m RNA表达:CAE+LPS处理4h后,转染组细胞CHOP表达量明显高于未转染组(P0.05);而处理8h及24h后,未转染组与转染组之间均无明显差异(P0.05);CAE处理的细胞,各时间点转染组细胞的CHOP m RNA表达量均明显高于未转染组细胞(P0.05)。CAE+LPS处理后的细胞的CHOP m RNA表达量明显高于CAE处理后细胞,CAE处理后的细胞的CHOP m RNA表达量又明显高于对照组的细胞(P0.05)。CAE+LPS处理后的转染组细胞的CHOP m RNA表达量明显高于其它所有组(P0.05)。3 GRP78的表达:未转染细胞对照组可见GRP78极少量表达,而转染细胞对照组表达量明显高于前者(P0.05)。未转染细胞CAE组与未转染细胞CAE+LPS组的表达量有显著的统计学差异(P0.05),同样均明显高于未转染细胞对照组表达量(P0.05)。转染组细胞CAE组及CAE+LPS组表达量有显著的统计学差异(P0.05),同样均明显高于其余各组(P0.05)。4 Caspase-12的表达:依据XBP1是否敲低比较:CAE+LPS处理4h、8h及24h后,转染组表达量均明显高于未转染组(P0.05);而随着时间的进展,其表达量均在8h时达到高峰,在24h的表达量与8h并无明显差异(P0.05)。CAE处理的细胞各时间点转染细胞表达量同样均明显高于未转染细胞(P0.05);而它们各自的表达量的高低与处理后时间的进展并无显著联系;对照组各时间点转染细胞表达量同样均明显高于未转染细胞(P0.05),随着时间进展也并无明显变化。依据处理程度比较,CAE+LPS组的细胞无论转染还是未转染,除4h时间点外,8h及24h其表达量均明显高于CAE组(P0.05)。XBP1基因是否敲低与处理AR42J细胞的程度也同样具有交互作用(P0.05),可认为CAE+LPS处理组的转染组细胞的ERS相关凋亡水平明显高于其它所有组。5 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡及坏死比例:转染组细胞在CAE处理24 h后,凋亡细胞比例明显高于同处理下未转染组(P0.05);而在CAE+LPS处理24h后,凋亡比例明显高于同处理未转染组(P0.05),坏死比例也是明显低于同处理未转染组(P0.05);对照组细胞,转染细胞的凋亡比例明显高于未转染组(P0.05),坏死比例则无明显差异(P0.05)。未转染细胞CAE+LPS组其坏死细胞及凋亡细胞比例均明显高于CAE组(P0.05),而CAE组凋亡细胞及坏死细胞比例又均明显高于对照组(P0.05)。转染细胞CAE+LPS组其坏死细胞及凋亡细胞比例均明显高于CAE组(P0.05),而CAE组凋亡细胞比例又明显高于对照(P0.05),坏死细胞比例则无明显差异(P0.05)。结论:1成功地分别应用CAE建立了MAP模型,CAE+LPS建立了SAP模型。2 ERS明确参与了AP的疾病进展过程。3敲低XBP1表达后所产生的ERS介导的凋亡,能够使发生AP时坏死细胞的比例明显减少,因而可能减轻AP的严重程度。这一效应在SAP中更为显著。4 XBP1是ERS应答机制中的一个重要因子,它能够促进内质网功能恢复,减轻内质网应激。对XBP1的沉默能够加重内质网应激,促进胰腺腺泡细胞凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576

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本文编号：1690903