益气活血方调节肝脏细胞自噬及逆转肝纤维化机制的研究

发布时间：2018-04-09 22:24

本文选题：四氯化碳　切入点：肝纤维化　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:肝纤维化是慢性肝损伤的修复反应以及细胞外基质沉积和代谢失衡的结果。尽管肝纤维化的发生机制的阐明已经取得了重大进展,但仍然缺乏有效的抗肝纤维化策略。然而中药在抗肝纤维化治疗中具有多层次、多途径、多靶点的综合作用,我们的自拟益气活血方是由黄芪、丹参、云苓、郁金、白豆蔻等中药组成,具有“益气活血,疏肝健脾”之功效,有研究发现黄芪甲苷可抑制细胞过度自噬从而发挥对受损细胞的保护作用。自噬(autophagy)是一些有缺陷的细胞器和未折叠蛋白被双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体中进行降解并得以循环利用从而维持细胞内平衡的代谢过程。近年研究发现,自噬能通过降解脂滴为肝星状细胞活化提供能量,并影响肝星状细胞的增殖及胶原纤维的产生,但自噬在肝纤维化中的作用以及益气活血方对自噬的调控作用及分子机制尚不清楚。本研究以CCl4诱导Wistar大鼠肝纤维化模型,以扶正化瘀复方为阳性对照,应用益气活血方进行治疗研究,明确益气活血方能否有效逆转/延缓肝纤维化进展,并进一步探明肝脏细胞自噬与肝纤维化发生发展的关系,以及益气活血方是否可通过肝脏细胞自噬阻止肝纤维化进展,为肝纤维化的防治提供新的策略及科学依据。方法:选用健康雄性Wistar大鼠,并随机分为4组进行实验研究,模型组:采用30%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)腹腔注射建立肝纤维化模型;益气活血方干预组:CCl4腹腔注射联合益气活血冲剂灌胃;扶正化瘀方干预组:CCl4腹腔注射联合扶正化瘀复方灌胃;对照组:等体积橄榄油代替CCl4及等体积的生理盐水代替益气活血冲剂灌胃,均喂养8周,水合氯醛麻醉下处死动物,留取血清标本;肝组织部分采用4%中性甲醛溶液固定,备行肝组织病理学及免疫组织化学分析,其余肝组织液氮快速冷冻后储存于-80℃冰箱,以备蛋白及m RNA检测。1实验大鼠一般情况:观察大鼠活动力、毛发、进食及存活情况。2血清生化学变化:采用全自动生化分析仪、酶法测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)水平。3肝组织病理学及免疫组织化学观察:4%中性甲醛溶液固定肝组织标本,经石蜡包埋,行5μm组织切片,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson三色染色观察肝脏炎症及纤维化程度;采用免疫组织化学染色观察肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原α1链(alpha-1 type I collagen,Col1A1)的表达,应用Image-Pro Plus图像分析软件进行半定量分析,每张切片随机选取10个视野(200×),测定α-SMA及Col1A1表达的累积光密度(integrated optical density,IOD)。4肝脏细胞自噬及纤维化相关基因表达检测:采用-80o C冰箱储存肝组织标本,分别提取蛋白和RNA,实时定量PCR及Western blot检测肝纤维化相关基因α-SMA和Col1A1的表达及自噬相关因子自噬蛋白7(Autophagy-related gene 7,Atg7)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)及泛素结合蛋白(SQSTM1/p62)的表达。采用Image J分析系统软件分析Western blot电泳条带灰度值,计算蛋白相对表达量。5统计学分析:所有数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,各组间比较均采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验,P0.05为差异有统计学意义。结果:1实验动物一般情况:对照组大鼠全部存活,精神饱满,活泼好动,毛发有光泽,摄食、饮水正常;模型组大鼠存活6只,精神萎靡,活动迟缓无力,毛发无光泽,摄食及饮水均明显减少,造模过程中6只动物死亡;益气活血及扶正化瘀中药干预组分别有6只大鼠存活,精神可,活动自如,毛发略有光泽,摄食、饮水可,二组各有3只动物死亡。2 ALT、AST检测:分别检测对照组、CCl4肝纤维化模型组、益气活血方干预组和扶正化瘀复方干预组大鼠血清ALT、AST水平,结果显示CCl4肝纤维化模型组大鼠血清ALT、AST水平较对照组显著升高,依次为106.80±18.24 vs 38.17±4.99,278.40±66.14 vs 121.00±11.87,差异有统计学意义(P0.001);益气活血方干预组大鼠血清ALT、AST水平较CCl4肝纤维化模型组显著降低,依次为66.80±10.42,122.60±16.65,差异有统计学意义(P0.001);扶正化瘀复方干预组大鼠血清ALT、AST水平较CCl4肝纤维化模型组也有所改善,依次为73.20±10.33,125.4±16.92,差异有统计学意义(P0.001)。3肝组织病理学变化:对照组肝小叶结构均正常,肝索排列整齐,肝板以小叶中央静脉为中心呈放射状排列;CCl4肝纤维化模型组肝小叶结构紊乱,可见点、灶状肝细胞坏死及窦周纤维化,汇管区纤维组织增生,纤维间隔形成(S5.64±0.22,vs对照组,P0.01);益气活血方干预组肝纤维化程度较CCl4肝纤维化模型组明显减轻(S3.70±0.35,vs模型组,P0.01);扶正化瘀复方干预组肝组织纤维化程度亦较模型组好转(S3.9±0.34,vs模型组,P0.01)。4肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3B和p62 m RNA表达:CCl4肝纤维化模型组大鼠肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B m RNA表达较对照组均显著上调,p62下降,依次为0.88±0.13 vs 0.19±0.07,0.99±0.075vs 0.05±0.024,1.11±0.12 vs 0.33±0.07,0.92±0.072 vs 0.32±0.02,1.16±0.17vs 3.18±0.18,P0.001;与CCl4肝纤维化模型组相比,益气活血方干预组肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B m RNA表达明显降低,p62上升依次为0.34±0.05,0.32±0.09,0.66±0.08,0.66±0.07,1.79±0.09,P0.01;扶正化瘀干预组肝组织与CCl4肝纤维化模型组相比α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B m RNA表达明显降低,p62略上升依次为0.48±0.043,0.31±0.11,0.74±0.07,0.58±0.03,1.45±0.03,P0.05。5肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3BII和p62蛋白表达:CCl4肝纤维化模型组大鼠肝组织α-SMA和Col1A1累积光密度值较对照组均显著增加,为34675.09±1200.29 vs 10360.13±1442.25,22480.85±1035.92 vs2915.58±574.99,P0.001;与CCl4肝纤维化模型组相比,益气活血方干预组肝组织α-SMA和Col1A1累积光密度值均明显下降,分别为22051.47±1610.70、12565.8±932.23,P0.001;扶正化瘀复方干预组与CCl4肝纤维化模型组相比肝组织α-SMA和Col1A1累积光密度值亦明显下降,分别为22556.52±1510.60、12997.9±903.85,P0.001;CCl4肝纤维化模型组小鼠肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表达较对照组均显著增强,依次为0.83±0.05 vs 0.05±0.006,0.73±0.002 vs 0.29±0.02,0.12±0.002 vs 0.06±0.002,0.83±0.024 vs 0.53±0.02,P0.001;益气活血方干预组肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表达明显降低,依次为0.19±0.02,0.35±0.003,0.10±0.002,0.67±0.02,P0.001;扶正化瘀复方干预组肝组织α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表达也明显降低,依次为0.31±0.02,0.47±0.003,0.10±0.003,0.62±0.03,P0.001;CCl4肝纤维化模型组小鼠肝组织p62蛋白表达较对照组均显著降低,为0.26±0.02 vs 0.68±0.03,P0.001;益气活血方和扶正化瘀方干预组肝组织p62蛋白表达均明显改善,分别为0.45±0.02,0.35±0.04,P0.001。结论:1肝脏细胞自噬可能为肝纤维化发生发展的重要机制之一,自噬相关基因Atg7、LC3BII及p62表达在CCl4诱导肝纤维化的发生发展中具有重要作用。2益气活血方与扶正化瘀方均可通过抑制肝脏细胞自噬,调节肝星状细胞的活化、细胞间基质的分泌与沉积,进而阻止或逆转肝纤维化。3益气活血方重在益气健脾、活血行瘀,在改善肝脏理化指标的基础上,可多靶点发挥抗肝纤维化作用,有望成为治疗肝纤维化、肝硬化的新型中药方剂。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2

【参考文献】