IL-9在幽门螺杆菌感染中的作用和机制研究

发布时间：2018-04-10 00:41

本文选题：H.pylori　切入点：infection　出处：《第三军医大学》2014年硕士论文

【摘要】：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种革兰氏阴性螺旋杆菌,主要定植于人胃及十二指肠粘膜局部。与慢性胃炎、胃十二指溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤等疾病密切相关，并被世界卫生组织（WHO）列为Ⅰ类致癌因子。研究表明，机体感染H.pylori后可产生一定程度的免疫应答反应，但这种应答并不能有效地清除病原体，反而造成H. pylori感染的慢性化，导致相关胃十二指肠疾病发生。虽然现在对H.pylori感染相关的免疫应答机制研究日益深入，但目前的研究结果仍然不能完整诠释H.pylori感染所产生的机体免疫应答规律和感染慢性化后免疫损伤造成胃肠疾病发生的复杂机制。因此，有必要对这一复杂机制进行更加广泛而深入的探究。众所周知，关于H.pylori感染免疫应答机制以往研究主要集中在Th1、Th2、Th17及Treg细胞。然而，2008年，Nature Immunology杂志上两篇研究相继报道了一类不同于TH1、Th2和Treg细胞的新Th细胞亚群，该亚群细胞的效应因子以IL-9为主，被称为Th9细胞。Th9新亚群的发现使得研究者不得不重新审视以往的Th亚群分类以及相应的免疫学功能，目前，关于Th9/IL-9的研究报道并不多见，主要集中于过敏性炎症、自身免疫性疾病和寄生虫感染等。对于Th9细胞在病原体感染的免疫应答作用以及在多种炎症性疾病和自身免疫性疾病中的免疫调控机制研究正逐渐开展。然而，目前关于Th9在H.pylori感染中作用机制的研究尚未见文献报道，因此，在现有Th细胞亚群研究尚不能诠释H.pylori感染的复杂应答机制现状下，，开展Th9/IL-9相关免疫学研究将为深入认识H.pylori自然感染和抗感染免疫机制提供新的线索和思路。本课题选取野生型及IL-9敲除小鼠模型，研究H.pylori感染后小鼠胃黏膜组织中幽门螺杆菌定植量及相关细胞因子的变化情况，从而分析机体的免疫应答情况。目的：通过检测幽门螺杆菌感染小鼠胃粘膜H. pylori定植量及相关细胞因子的水平变化情况，分析机体的免疫应答状态。从而为研究H.pylori感染的免疫应答机制提供新线索和思路。并为临床应用提供新的参考。方法：体内实验 1.幽门螺杆菌培养复苏实验所用B0菌株（Balb/c小鼠H. pylori感染模型适应株的初代分离菌），三线法接种于血平板中培养2d后洗脱细菌，转移至液体培养基中扩大培养1d。调整细菌浓度为108CFU/ml，用于细菌感染实验。 2.小鼠细菌感染方式将实验小鼠断食水5h后，灌喂H. pylori菌液，0.3ml/只，1次/日，连续4天，灌喂H. pylori菌液1h后进食水。对照组以PBS替代，其余处理相同。 3.小鼠胃粘膜H. pylori定植量检测于小鼠感染H. pylori后2周、4周时，提取小鼠胃粘膜DNA，采用实时定量PCR检测幽门螺杆菌16SrDNA。判断Hp定植情况。 4.小鼠胃粘膜细胞因子RNA的检测于小鼠感染H. pylori后2周、4周时，提取小鼠胃粘膜组织总RNA，采用实时定量PCR检测胃粘膜中IL-9,IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A及FoxP3+的RNA表达水平。 5.小鼠眼球血中IL-9表达量的检测于小鼠感染H. pylori后2周、4周时，采用ELISA法检测小鼠眼球血中IL-9的表达量。 6.小鼠胃粘膜,IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A表达量的检测于小鼠感染H. pylori后2周、4周时，采用ELISA法检测胃组织匀浆上清中IL-9,IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A的表达量。 7.小鼠胃粘膜组织炎症程度分析于小鼠感染H. pylori后2周、4周时，采用HE染色评价小鼠胃粘膜组织炎症程度。 8.小鼠炎症程度评分胃黏膜炎症分级积分参照Rauws分级标准:黏膜固有层炎症细胞(单核细胞)浸润的密度(0～2分);黏膜固有层嗜中性多核粒细胞浸润的密度(0～3分);黏膜上皮内嗜中性多核粒细胞的密度(0～3);浅表糜烂的程度(0～2分);对每个参数,0是没有,1分是轻度,2分是中度,3分是重度.应用总积分0～10分的变化来衡量胃炎的程度。 9. H. pylori超声抗原的制备及浓度测定采用培养1天的B0菌株在超声破碎仪下制备H. pylori超声抗原，并用BCA法测定超声上清中蛋白浓度。 10.数据分析使用SPSS13.0进行统计学分析。采用非配对T检验检测胃粘膜H. pylori定植量。其它数据采用单因素方差分析。所有数据均采用平均数±标准差表示。p≤0.05为有统计学差异。体外实验 1.实验细胞来源：Hp感染后IL-9敲除和wt Balb/c小鼠的脾细胞，未处理组作为对照。 2. B细胞分离：用CD19+阳选磁珠从H. pylori未感染的IL-9和wt balb/c小鼠脾细胞中分离出B cell做抗原提呈细胞。 3.抗原负载：1*106/孔APC负载/不负载H. pylori超声上清抗原（终浓度10ug/ml）24孔板，24h，不完全1640洗2遍2000rad辐照。设平行对照孔3孔。 4. CD4+T细胞分离：用CD4+CD25+阳选磁珠从H. pylori感染的IL-9和WT balb/c小鼠脾细胞中将CD4+CD25-TCell和CD4+CD25+TCell（Terg细胞）两群细胞分选出来（纯度90%-95%）。 5. APC与CD4+T细胞共培养：按照APC（2*105）:T cell（4*105）为1:2的比例将上面两类T cell加入到96孔平底板中孵育96h（细胞用以检测增殖，48h及96h培养上清ELISA检测细胞因子（IFN-r、IL-17、IL-4、IL-10）的蛋白水平。96h后每孔加入1uCi of [3H]-thymidine，混匀，继续培养12-16h送西南医院核医学科进行液闪计数仪测定每分钟脉冲数检测T cell增殖情况。结果用刺激指数（SI）表示。SI=实验组cpm均值/对照组cpm均值。 6.数据分析使用SPSS13.0进行统计学分析。采用用单因素方差分析。所有数据均采用平均数±标准差表示。p≤0.05为有统计学差异。结果：体内实验： 1.感染H. pylori的野生型Balb/c小鼠在4周时，其胃粘膜组织幽门螺杆菌的定植量升高明显。IL-9、IFN-γ、IL-17A及Foxp3+mRNA水平上升，IL-4及IL-10有上升趋势但差异不明显。IL-9、IFN-γ及IL-17A的蛋白表达量上升，而IL-4及IL-10的蛋白表达量变化不明显。感染H. pylori的野生型Balb/c小鼠在4周时小鼠胃组织粘膜炎症较未感染组严重。同时与2周及1周感染组相比炎症也较重。 2.感染H. pylori的IL-9敲除小鼠在4周时，其胃粘膜组织幽门螺杆菌的定植量较野生型Balb/c小鼠升高。IL-17A及Foxp3+mRNA水平较野生型Balb/c小鼠下降，IFN-γ的mRNA水平上升明显，IL-4及IL-10变化不明显。IFN-γ蛋白表达量上升，IL-17A蛋白表达量下降明显，IL-4及IL-10的蛋白表达量变化不明显。感染H. pylori的IL-9敲除小鼠在4周时小鼠胃组织粘膜炎症较野生型Balb/c，小鼠严重。且两组感染组也较未感染组的炎症重。 3.在感染H. pylori的同时将重组小鼠IL-9细胞因子回注到IL-9敲除小鼠体内，在4周时，回注IL-9组小鼠胃粘膜组织幽门螺杆菌的定植量较对照组显著降低。IL-17A的mRNA水平较对照组上升，IFN-γ的mRNA水平下降明显，IL-4、IL-10及Foxp3+在各组间变化不明显；IL-17A的蛋白表达量较对照组上升，IFN-γ蛋白表达量则下降，IL-4及IL-10的蛋白表达量变化不明显。在感染H. pylori的同时将重组小鼠IL-9细胞因子回注到IL-9敲除小鼠体内，在4周时，回注IL-9组小鼠胃粘膜组织幽门螺杆菌的炎症程度较对照组减轻。 4.在感染H. pylori的同时将重组小鼠IL-9细胞因子回注到野生型Balb/c小鼠体内，在4周时，回注IL-9组小鼠胃粘膜组织幽门螺杆菌的定植量较对照组降低。IL-17A及IL-10的mRNA水平较对照组上升，IFN-γ的mRNA水平下降。IL-4及Foxp3+的mRNA水平则无明显变化。回注IL-9组小鼠胃粘膜组织中IL-17A及IL-10的蛋白表达量较对照组上升，IFN-γ的蛋白表达量则下降。IL-4的蛋白表达量在4周时变化不明显。在感染H. pylori的同时将重组小鼠IL-9细胞因子回注到野生型Balb/c小鼠体内，在4周时，回注IL-9组小鼠胃粘膜组织幽门螺杆菌的炎症程度较对照组减轻。体外实验 1.感染H. pylori的野生型Balb/c小鼠和IL-9敲除小鼠脾细胞中分离出的CD4+CD25-TCells及CD4+CD25+TCells经H. pylori抗原刺激后野生型Balb/c小鼠脾细胞中的CD4+CD25-TCells的增殖能力较IL-9敲除小鼠增强。 2.感染H. pylori的野生型小鼠脾细胞中分离出的CD4+CD25-TCell细胞经H.pylori抗原刺激后其培养上清中IL-17A表达量较IL-9敲除小鼠高，IFN-γ的表达量较IL-9敲除小鼠低，IL-4及IL-10未见明显变化。结论： 1.针对临床上H.pylori感染所产生的机体免疫应答规律和感染慢性化后免疫损伤造成胃肠疾病发生的复杂机制，首次从IL-9应答角度探讨H.pylori自然感染的作用机制。 2.采用不同的实验动物模型（野生型Balb/c小鼠，IL-9KO小鼠，rIL-9回注IL-9KO小鼠及rIL-9回注野生型Balb/c小鼠）证实IL-9通过促进IL-17A的表达及降低IFN-γ的表达对H.pylori的感染起保护性作用。 3.成功分离IL-9KO小鼠和野生型Balb/c小鼠脾细胞中的CD4+CD25-T细胞，发现IL-9KO小鼠的CD4+CD25-T细胞高表达IFN-γ而低表达IL-17A，此结果与体内实验一致，再次证实IL-9通过促进IL-17A的表达及降低IFN-γ的表达对H.pylori的感染起保护性作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R573

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