AhR活化对肠粘膜屏障功能的保护作用及机制研究

发布时间：2018-04-12 22:31

本文选题：芳香烃受体 + 肠黏膜屏障　；参考：《第三军医大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的与背景:肠粘膜屏障(Intestinal epithelial barrier,IEB)是肠道重要的结构和功能屏障。IEB不仅能参与肠道结构维系,也能通过调控肠道物质的消化吸收,提供机体生长发育所必须的营养物质。同时,IEB抵御和清除致病菌,并维系机体内稳态。但各种急慢性病理条件的刺激,均可能引起IEB功能障碍,继发肠道功能紊乱,甚至导致肠源性感染和全身性炎症反应。肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)是肠粘膜屏障最主要的结构组成。在连续相邻的细胞膜之间,紧密连接和紧密连接相关蛋白,比如膜蛋白claudins,occludins以及胞质斑蛋白zonula occludens(ZO),共同构成一个具有选择性通透性的复合体。它不仅是肠粘膜的重要组成部分,也是调控肠粘膜细胞旁通路的关键元件。近来发现,缺氧或LPS刺激下,肌球蛋白轻链(MLC)受到肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的激活而发生磷酸化,诱发肠粘膜紧密连接蛋白ZO-1的结构和功能破坏,引起肠粘膜屏障通透性的增加。因此,MLCK-pMLC磷酸化通路在介导肠粘膜屏障的破坏中发挥重要作用,其机制就是紧密连接的破坏。芳香烃受体(Aryl Hydrocarybon Receptor,AhR),一种需要与配体配对并激活的核转录因子,广泛表达于机体的各个组织和细胞。与配体结合以后,活化的AhR由胞浆转移入核,随后与AhR核转位子(AhR Nuclear Translocator,ARNT)形成异源二聚体,调控目的基因表达。研究发现,内源性配体比如吲哚并[3,2-B]咔唑-6-甲醛(6-formylindolo(3,2-b)carbazole,FICZ)能够活化AhR,参与细胞生理功能的维持,如细胞的增值、凋亡以及免疫反应等。越来越多的证据表明,AhR在调节肠粘膜屏障功能上发挥着重要作用。其中,大部分都是研究AhR在肠道免疫细胞中的作用,比如在肠道固有单核细胞(Lamina propria mononuclear cells,LPMCs)中上调IL-22来抑制免疫反应等。而事实上,AhR在肠上皮细胞中也大量表达,并且肠上皮细胞有更多的机会与AhR从食物来源以及菌群共生产生的内源性配体接触。本课题拟在模拟体内肠梗阻模型以及体外缺氧模型,通过跨膜电阻检测、蛋白质免疫印迹、realtime-PCR、免疫荧光等技术,探讨肠梗阻缺血缺氧条件下AhR的活化是如何参与调控肠屏障功能,并探讨其中作用机制,为患者肠粘膜功能的保护提供新思路。方法:1、建立小鼠肠梗阻模型,应用HE染色、组织学评分、Ussing Chamer技术,观察肠粘膜损伤情况。2、通过免疫荧光、realtime-PCR技术,观察AhR分布表达以及活性的变化。3、利用免疫荧光、realtime-PCR技术,观察肠梗阻模型中紧密连接蛋白ZO-1分布与表达的变化。4、利用免疫荧光、realtime-PCR技术,观察肠梗阻模型中MLCK、pMLC分布与表达的变化。5、构建体外Caco-2缺氧模型,通过蛋白质免疫印迹、realtime-PCR技术、TER检测,进一步观察缺氧条件下,FICZ活化AhR后,肠细胞屏障损伤情况以及MLCK-pMLC通路的影响。6、通过干扰AhR,通过蛋白质免疫印迹技术,观察缺氧条件下AhR缺陷对MLCK-pMLC通路的影响。结果:1、小鼠肠梗阻模型中,肠粘膜正常形态学改变,绒毛断裂、水肿,上皮细胞脱落,chiu氏组织评分增加,粘膜通透性增加。而加入AhR激动剂FICZ后,肠粘膜损伤缓解。2、小鼠肠梗阻模型中,紧密连接蛋白ZO-1连续性断裂,表达减弱。而加入FICZ后,ZO-1连续性有所恢复。3、小鼠肠梗阻模型中,MLCK、pMLC表达明显增强。而FICZ后,抑制了两者表达。4、体外Caco-2缺氧模型中,AhR的活化抑制了MLCK和pMLC蛋白水平表达,同时维持了ZO-1的表达分布。通透性实验显示肠细胞屏障得到恢复。5、体外Caco-2缺氧模型中,AhR的缺陷能够诱导MLCK-pMLC通路的开放。结论:1、肠梗阻模型中,AhR活化能缓解肠屏障功能损伤。2、肠梗阻模型中,AhR活化对肠屏障的保护作用是通过维护肠上皮紧密连接ZO-1的形态来实现。3、AhR活化对MLCK-pMLC通路的抑制是AhR调节紧密连接潜在机制。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574

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