吗啡对拉米夫定抗HIV-1药效和诱导耐药性突变的影响

发布时间：2018-04-16 07:04

  本文选题：吗啡 + HIV-1　； 参考：《广西医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：第一部分：吗啡对HⅣ-1在MT2细胞和巨噬细胞中复制的影响目的：探讨吗啡对艾滋病Ⅰ型病毒(HⅣ-1)在MT2细胞和巨噬细胞中复制的影响。方法：MT2细胞随机分为4份,依据不同处理方式分为4组：吗啡处理MT2细胞组(A组)、吗啡+纳洛酮共处理MT2细胞组(B组)、纳洛酮处理MT2细胞组(C组)和MT2细胞-病毒对照组(D组)；巨噬细胞也随机分为4份,依据不同处理方式分为4组：吗啡处理巨噬细胞组(E组)、吗啡+纳洛酮共处理巨噬细胞组(F组)、纳洛酮处理巨噬细胞组(G组)和巨噬细胞-病毒对照组(H组)。先用浓度为10-8mol/L的纳洛酮预处理B、C、F和G组0.5小时,再用10-12、10-10和10-8mol/L 3个浓度的吗啡处理A和E组24h,同时用浓度为10-10mol/L的吗啡处理B和F组24h；24h后8组细胞分别加入终浓度为100TCID50的HIV-1 B'亚型毒株。HⅣ-1感染A-D组的第3、4、5和6天,取培养上清,用ELISA双抗体夹心法检测p24抗原表达；HⅣ-1感染E～H组的第4、6、8、10和12天,取培养上清,用ELISA双抗体夹心法检测p24抗原表达。用Student-t检验或方差分析(ANOVA)比较不同细胞处理组间p24抗原表达差异；采用重复测量数据方差分析的方法比较不同时间A和E组分别比D和H组的p24抗原表达增加或减少倍数的变化趋势。结果：1.HⅣ-1感染MT2细胞第3-6天,A组的p24抗原表达均高于D组,差异有统计学意义(P均0.01)；2.HⅣ-1感染MT2细胞第3-6天,B、C和D组的p24抗原表达两两比较,差异没有统计学意义(P均0.05);3.3个浓度的A组的p24抗原表达比D组增加的倍数,随HIV-1感染MT2细胞的时间的延长具有上升的趋势,重复测量趋势性分析结果显示,时间效应具有统计学意义(F=842.18,P0.01)。4.HⅣ-1感染巨噬细胞第4-10天,E组的p24抗原表达均高于H组,差异有统计学意义(P均0.01)；5.HⅣ-1感染巨噬细胞第4-10天,F、G和H组的p24抗原表达两两比较,差异无统计学意义(P均0.05)；6.3个浓度的E组的p24抗原表达比H组增加的倍数,随HIV-1感染时间的延长具有上升的趋势,重复性测量趋势性分析结果显示,时间效应具有统计学意义(F=135.58,P0.01)。结论：1.吗啡能够促进HⅣ-1在MT2细胞和巨噬细胞内的复制,并且随着感染时间的延长促进的作用程度增强；2.吗啡的促进HⅣ-1复制到作用可被纳洛酮阻断。第二部分：吗啡对拉米夫定抗HⅣ-1药效的影响目的：探讨吗啡是否能够影响拉米夫定(3TC)抗HⅣ-1的抗病毒效果。方法：MT2细胞铺在48孔培养板,将各孔MT2细胞和巨噬细胞顺序编号,按照随机数据表进行分组：吗啡+3TC处理组(A组)、吗啡+纳洛酮+3TC处理组(B组)、纳洛酮+3TC处理组(C组)、3TC对照组(D组)和病毒对照组(E组)；用浓度为10-8 mol/L的纳洛酮处理B和C组0.5h,然后用浓度为10-12、10-10和10-8 mol/L的吗啡处理A组24h,按照吗啡浓度从小到大,A组又分为：A1、A2和A3组；用浓度为10-10 mol/L的吗啡处理B组24h；最后每组细胞加入等量的HIV-1ⅢB毒株和3TC溶液;HⅣ-1感染MT2细胞第3、4、5和6天,每天取培养上清,用ELISA双抗体夹心法检测培养上清的p24抗原表达,根据p24抗原表达量和公式：p24抗原抑制率%=[(病毒对照组p24抗原值-给药组(A、B、C和D组)p24抗原值)／病毒对照组p24抗原值]×100%,计算A、B、C和D组的3TC抗HIV-1 p24抗原抑制率。结果：1.HⅣ-1感染细胞第3天,A1、A2和A3组的3TC抗HIV-1 p24抗原抑制率最低,与D组相比差异有统计学意义(P均0.05)；2.HⅣ-1感染细胞第4天,A1和A2组的3TC抗HIV-1 p24抗原抑制率与D组相比差异有统计学意义(P均0.05),而A3组的3TC抗HIV-1 p24抗原抑制率与D组相比差异没有统计学意义(P均0.05)；3.HⅣ-1感染细胞第3和第4天,B和C组的3TC抗HIV-1 p24抗原抑制率相当,两组间差异没有统计学意义(P0.05),这两组分别与D组相比,差异没有统计学意义(P0.05)；4.病毒感染细胞第5和第6天,A1、A2、A3、B和C组的3TC抗HIV-1 p24抗原抑制率与D组相比,差异没有统计学意义(P0.05);5.A-D组的3TC的抗HIV-1 p24抗原抑制率随着感染时间的延长而降低,呈现时间—效应关系。结论1.吗啡在病毒感染初期能降低3TC的抗HⅣ-1药效；2.纳洛酮能够阻滞吗啡降低3TC的抗HⅣ-1药效的作用。第三部分：吗啡对3TC诱导HⅣ-1耐药的影响目的：通过体外细胞-病毒传代培养,观察吗啡对我国HIV-1 B'亚型野生毒株诱导成耐药毒株的影响,并诱导出能稳定传代的HIV-1 B'亚型耐药株。方法：MT4细胞铺在48孔培养板,将各孔细胞顺序编号,按照随机数据表进行分组：吗啡+3TC处理组(Ⅰ组)、吗啡处理组(Ⅱ组)、3TC处理组(Ⅲ组)和病毒对照组(Ⅳ组)。用浓度分别为10-10、10-8和10-6 mol/L的吗啡预处理Ⅰ和Ⅱ组2h,按照吗啡浓度从小到大,Ⅰ组又分为：Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅰ3组；Ⅱ组又分为：Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅱ3组；然后每组细胞加入终浓度为100TCID50从我国河南病人分离出来的类似泰B’亚型HⅣ-1毒株,最后加入终浓度为3.5gM/L的3TC药物溶液,保持吗啡和3TC的浓度不变传代(一代6天,即1周)培养病毒,每周收集培养上清,并传给下一代病毒,每次实验共培养8-10周。每周提取培养上清的病毒RNA,用巢式PCR法扩增HIV-1 pol区基因,收集目的片段并测序,将所得的DNA序列拼接后提交到斯坦福大学的HIV Drug Resistance Database(http://hivdb.stanford.edu/),进行基因型耐药性分析。收集4次实验的结果,用Student-t检验比较不同处理组产生突变的差异。结果：1.Ⅰ组能诱导HⅣ-1产生M184I、V118I、T69N、T215I、D67G和V90I耐药突变；Ⅱ组能诱导HⅣ-1产生Ⅴ118I、V90I和T215I突变：Ⅲ组能诱导HⅣ-1产生M184I、M184Ⅴ和Ⅴ118I突变；Ⅳ组未发现突变。2. Ⅰ1组诱导HⅣ-1产生M184I突变的时间短于Ⅳ组,差异有统计学意义(P0.05)；3.Ⅰ组和Ⅲ组诱导HⅣ-1产生V118I/V突变的时间与Ⅳ组比较,差异无统计学意义(P0.05)；4. Ⅰ组诱导HⅣ-1最早产生M184I突变的时间短于Ⅳ组,差异具有统计学意义(P0.05)；5.Ⅰ组诱导HⅣ-1最早产生V118I/V突变的时间与Ⅳ组比较,差异无统计学意义(P0.05)；6.在病毒培养8-10周的时间内,Ⅰ1和Ⅰ2组存在M184I突变的时间长于Ⅳ组,差异有统计学意义(P0.05)；7.Ⅱ1和Ⅱ2组存在Ⅴ118I/Ⅴ突变的时间长于Ⅳ组天,差异有统计学意义(P0.05)结论：1.吗啡能够缩短3TC诱导HⅣ-1病毒产生M184I核苷类主要耐药突变的时间,并辅助产生M1841和Ⅴ118I突变的耐药株的复制；2.在吗啡的作用下,3TC可诱导HⅣ-1产生更多类型的多态性突变;3.诱导和培育出可能稳定传代的M184V和M1841耐药株,可用于HⅣ-1耐药性的研究和HⅣ-1药物的药效学评价。
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本文编号：1757783