Chemerin对炎症性肠病（IBD）和肝癌炎症微环境的调节作用的初探

发布时间：2018-04-20 18:26

  本文选题：IBD + Chemerin　； 参考：《复旦大学》2014年博士论文

【摘要】：炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组反复发作的慢性炎症性肠道疾病,主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD)。 IBD在西方国家非常普遍,患病率达100-200/10万人。在我国,近10年来IBD的发病率上升了大约10～20倍。鉴于IBD严重危害患者健康并且IBD病人发生恶变的几率明显高于正常人群,研究人员花费了大量精力来探究IBD的致病机理。IBD的发病机制至今尚未完全阐明,目前认为,IBD是以遗传易感性为基础,环境因素参与,黏膜免疫系统对肠腔内抗原物质(如共生菌)的异常免疫应答而造成的肠道损伤。IBD病人在治疗上也仍存在很多问题,例如有部分患者对氨基水杨酸类、激素和免疫抑制剂等药物治疗不敏感以及药物存在毒副作用等。因而,深入研究其发病机制将是十分有意义的。目前,免疫因素在炎症性肠病的发病学中最为肯定,也是该病的发病机制研究中与治疗目标最接近者。众多资料显示,作为免疫系统重要组成部分的免疫细胞在IBD的发病机制中起重要作用。免疫细胞调控失常将导致肠道免疫缺陷、黏膜免疫耐受破坏、免疫系统异常激活,并最终导致炎症的发生。Chemerin是近年来新发现的一种趋化因子,也称他扎罗汀诱导基因2(TIG2)或维甲酸受体反应蛋白2 (RARRES2) 。 Chemerin在肝脏和白色脂肪组织中高表达,在肺脏、肾脏、垂体、胎盘及卵巢也有表达。Chemerin以18kDa的低活性的前体蛋白形式分泌,经丝氨酸蛋白酶水解C末端序列后转化为16k Da的具有生物活性的蛋白质。2007年研究人员还发现Chemerin也是一种脂肪因子,能够调节脂肪细胞分化和代谢,与胰岛素抵抗密切相关。更为重要的是,Chemerin可以作为一种趋化因子在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。Chemerin的受体是G蛋白偶联受体ChemR23, ChemR23主要表达在未成熟的树突状细胞、巨噬细胞和NK细胞表面,Chemerin通过与其受体ChemR23结合来发挥对表达CheR23细胞的免疫趋化作用,招募这些细胞到淋巴组织和炎症部位。Chemerin在多种炎症组织中存在,与组织炎症密切相关。最近的一些研究报道结果显示,在不同的炎症疾病模型中,Chemerin既可能发挥抗炎作用,又可能发挥促炎作用。有研究报道,在炎症性肠病病人的血清中的Chemerin的浓度增加,然而Chemerin对炎症性肠病中的发生发展起到何种作用目前尚不清楚。在本课题的研究中,我们利用DSS诱导的肠炎小鼠模型结合临床病人数据对Chemerin在炎症性肠病(IBD)中的作用及其机制进行了探究性研究。在第一小节的研究中,我们成功建立了DSS诱导的小鼠结肠炎模型,我们发现DSS诱导的肠炎小鼠中,无论是血清还是肠道局部组织,Chemerin的表达水平都是显著上升的。我们收集了UC病人结肠组织样本,同样发现Chemerin表达水平的上调,而且Chemerin的表达水平与肠炎的恶性程度呈正相关。在第二小节的研究中,我们在DSS诱导的小鼠肠炎小鼠中腹腔注射外源重组Chemerin蛋白,发现给予外源重组Chemerin可以显著促进DSS诱导的小鼠肠炎,DSS诱导的肠炎小鼠在给予Chemerin之后表现出更为严重的临床症状,如体重下降更为显著、结肠长度缩短加剧、DAI评分增高、结肠内部水肿、糜烂、出血、溃疡等现象加重；组织病理学上,给予Chemerin之后的肠炎小鼠更高的临床病理评分,切片观察可见更为严重的黏膜上皮紊乱、杯状细胞更为减少、细胞脱落更为严重、腺体破坏加剧、隐窝基本消失、黏膜下层更为增宽。这些加重的临床症状和病理评分证实了Chemerin对小鼠肠炎的促进作用。在第三小节的研究中,我们检测了给予Chemerin之后,DSS诱导的肠炎小鼠的血清中和肠道组织局部的促炎因子IL-6, TNF-a和IFN-γ的表达水平,发现这些促炎因子表达水平显著增加。我们接着检测了给予外源重组Chemerin是否影响结肠组织中炎症性细胞的趋化。结果我们发现,给予外源重组Chemerin并不影响结肠组织中炎症性细胞的浸润比例。在第四小节的研究中,我们检测了Chemerin是否影响巨噬细胞向M2的极化。我们发现,给予重组Chemerin可以显著降低DSS诱导的肠炎小鼠结肠组织中M2相关基因的表达,包括Arginase 1 (Arg-1)、Ym1、FIZZ1和IL-10,表明hemerin可能抑制了炎症小鼠结肠组织中巨噬细胞向M2的极化。在体外实验中,我们进一步证实了Chemerin可以抑制M2相关基因的表达,而这一抑制作用可能是通过Chemerin抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化来发挥的。在第五小节的研究中,我们使用Chemerin中和抗体进一步从反向验证了上述结论。我们发现给予Chemerin中和抗体可以显著抑制DSS诱导的小鼠肠炎。与前面结果相一致的是,阻断内源性的Chemerin虽然能够抑制促炎因子的表达,但是并不影响肠炎小鼠结肠组织中炎症细胞的浸润,而阻断内源性的Chemerin则能够显著增加M2相关基因的表达。综上所述,我们的研究结果表明Chemerin在DSS诱导的小鼠肠炎中起促进炎症的作用；Chemerin可以抑制巨噬细胞向抗炎的M2方向的极化,这可能是Chemerin促进肠道炎症的机制之一；肠道局部上调表达的Chemerin蛋白可能是IBD的发病机理之一。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),简称肝癌,是严重威胁人类生命的一种上皮类恶性肿瘤。肝癌早期发病隐匿,发展迅速,易转移,大多数患者在确诊时己发生转移,不宜或无法切除,这是肝癌致死率居于恶性肿瘤第三位的重要原因。因此,探讨肝癌发生和发展过程中的调控机制,不仅有助于完善肝癌分子网络,而且有助于发现新型肝癌标志分子、开发新的药物靶点,对肝癌临床诊断和治疗都具有重要的价值。传统的肝癌研究注重肿瘤细胞自身,试图从癌细胞本身基因与表型改变来解释肿瘤的发生发展与转移。最近的研究越来越关注作为肿瘤密不可分的局部微环境对肿瘤演进所起的重要作用。大量研究表明,很多恶性肿瘤存在炎症性的微环境。炎症与肿瘤的发生发展密切相关,炎症应答在肿瘤形成过程中的各个阶段(启动、恶变、转移)均发挥重要作用,炎症促肿瘤的具体细胞分子机制的研究是肿瘤免疫研究的热点之一。对于肝癌,炎症免疫微环境是其发生发展和侵袭转移中的重要组成部分。肝癌发生发展往往存在“炎-癌”链的作用,临床上大部分肝癌患者有乙型或(和)丙型肝炎以及肝硬化背景。炎症和肝硬化导致的细胞增殖异常可以促进肿瘤的演进和进展。因此,肝癌炎症微环境与肝癌的发生发展和复发转移有着密切的关系。肝癌炎症微环境中浸润着大量的免疫细胞,而且每种免疫细胞包括多种具有特异性表型和功能的亚群。例如,T淋巴细胞包括：Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞、Th17细胞、TFH细胞和细胞毒性T细胞等多种细胞亚群；巨噬细胞可根据表型和功能的不同分为经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophages, M1型巨噬细胞)和选择性激活的巨噬细胞(alternatively activated macrophages, M2型巨噬细胞)。此外,在肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中广泛存在着一群髓样来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC), MDSC又分为中性粒细胞样MDSC (PMN-MDSC)和单核细胞样MDSC (M-MDSC)俩个亚群。研究这些免疫细胞及其亚群在肿瘤“组织微定位”的表型、分布和功能有助于深入理解炎症反应调控肿瘤进展的机制,为新型免疫治疗提供理论支持。肝癌炎症微环境中的抗肿瘤和促肿瘤机制相互对抗,它们之间的博弈就像一场旷日持久的战争。在这场战役中,肿瘤微环境通过各种因子、介质诱导出一系列免疫抑制性的细胞。在肿瘤组织中,树突状细胞(DC)分化为具有免疫抑制功能的调节性DC (regulatory dendritic cells, DCreg),巨噬细胞分化为具有免疫抑制作用的肿瘤相关巨噬细胞(tum orassociated macrophage, TAM);此外,肿瘤组织中MDSC的正常分化也受到抑制并大量扩增。MDSC作为肿瘤组织中重要的免疫抑制细胞,参与了肿瘤的免疫逃逸、免疫耐受、免疫抑制等病理过程,促进了肿瘤的发生发展。肿瘤组织中的TAM具有M2的表型,可直接来源于组织常驻的巨噬细胞,也可由MDSC进一步分化而来。而肿瘤组织的MDSC来源于骨髓祖细胞和未成熟髓细胞,其中PMN-MDSC与M-MDSC发挥免疫抑制的机制不尽相同。肿瘤组织中PMN-MDSC的扩增明显高于M-DMSC,而且肿瘤组织中的M-MDSC可以分化为PMN-MDSC。肝癌组织中的MDSC以PMN-MDSC为主。Chemerin是近年来新发现的一种趋化因子,在肝脏和脂肪组织表达量最高。Chemerin的主要功能受体是G蛋白偶联受体ChemR23, ChemR23主要表达于未成熟DC (mDC)、pDC、巨噬细胞和NK细胞表面。Chemerin在组织免疫和炎症应答中发挥重要作用。在不同的疾病模型中,Chemerin既可以发挥促进炎症的功能,也可以发挥抑制炎症的功能。研究报道,Chemerin既可以通过介导pDC、mDC、单核细胞和粒细胞对组织的浸润来发挥调节炎症的作用,也可以通过影响炎症组织中的细胞因子、介质的表达来调控炎症应答,还可以通过调控各种免疫细胞的和基质细胞的功能来发挥作用。我们实验室对Chemerin在炎症中的调控作用也做了大量研究工作。我们发现,在系统性红斑狼疮的皮肤组织中,Chemerin可能通过促进pDC的浸润促进炎症;在过敏性哮喘小鼠的气道炎症中,Chemerin抑制炎性DC的气道浸润,从而下调Th2介导的过敏性炎症[12]。正如论文第一部分所叙述的那样,我们还发现,Chemerin在肠道炎症中发挥促炎作用,Chemerin可以抑制具有修复功能的M2巨噬细胞的应答,体外研究证实Chemerin通过抑制巨噬细胞STAT6的磷酸化来抑制IL-4诱导的M2巨噬细胞的极化。虽然Chemerin最初是从卵巢癌或肝癌患者的腹水中分离得到,但是Chemerin在肿瘤中的研究报道还很少,虽然一些研究结果提示了Chemerin与肿瘤发生发展中相关性,但是Chemerin影响肿瘤的具体机制的研究报道到目前为止还非常少,仅在2012年Pachynski R等研究报道Chemerin可能通过介导NK细胞对黑色素瘤肿瘤组织的浸润而发挥其抗肿瘤效应。文献报道人正常肝脏组织高水平表达Chemerin和ChemR23,肝细胞和肝星状细胞同时表达Chemerin和ChemR23;而肝脏Kupffer细胞和胆管细胞表达ChemR23而不表达Chemerin [18]。虽然Chemerin在肝脏中大量表达且作为脂肪因子在代谢中的作用已被大量研究,但是Chemerin与肝癌的相互关系却很少有人研究。只有2013年一篇来自国内的研究报道中提到肝癌组织中Chemerin的表达水平下调,并伴随着NK细胞浸润的降低,与预后相关,提示Chemerin可能参与肝癌的发生发展,但Chemerin如何影响肝癌及其具体作用机制尚未见任何报道。因此,我们在前期对Chemerin调节炎症的研究工作的基础上,结合Chemerin及其受体ChemR23在肝脏的高表达,进一步探究了Chemerin对肝癌及其相关炎症微环境的作用及其机制。在本课题的研究中,我们首先探究了Chemerin对肝癌的发生发展是否有作用,这种作用是促进还是抑制。在论文第一部分的研究中,我们发现Chemerin可以促进肠道组织的炎症的发生发展,而这种促进作用并不是通过Chemerin对免疫细胞的趋化作用而发挥的,而是通过Chemerin抑制肠道组织巨噬细胞向M2的极化而发挥促炎作用的。那么,在肝癌发生发展中,Chemerin是作为一种趋化因子影响免疫细胞的浸润来影响肿瘤的发生发展?还是通过影响免疫细胞或者基质细胞的功能来发挥影响肝癌的作用的呢?对此,我们进行了初步的探究。在第一小节研究中,我们收集肝癌患者的癌症组织和癌旁组织,用免疫组化的手段检测Chemerin在肿瘤组织中的表达变化,我们发现,相比癌旁组织,肿瘤组织中的Chemerin表达显著降低。我们利用组织芯片结合临床随访资料,确定了Chemerin与肝癌的恶性程度呈负相关,与预后呈正相关。通过检测不同侵袭能力的人肝癌细胞株以及肝癌和癌旁组织细胞中Chemerin的表达水平,发现Chemerin表达水平随着细胞转移能力的增强而降低,提示Chemerin与肝癌的恶性转移呈负相关。在第二小节研究中,我们利用稳定转染Chemerin基因的肝癌细胞株Hepal-6,建立了俩种小鼠肝癌模型,一种是肝癌的皮下移植瘤模型,另一种是肝脏原位移植瘤模型。在这俩种肝癌模型中,我们均发现过表达Chemerin可以显著抑制肝癌的发生发展。我们将稳定转染的Hepal-6细胞进行眼球后静脉丛注射,发现过表达Chemerin可以显著抑制肝癌细胞的肺转移。在第三小节的研究中,我们检测了过表达Chemerin对肝癌细胞Hepal-6本身生物学特性的影响,我们发现Chemerin不影响Hepal-6的增殖、凋亡、细胞周期和趋化。我们检测了肝癌组织浸润的免疫细胞的比例变化。我们发现Chemerin可以促进CD45+免疫细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞的浸润,显著减少巨噬细胞、M2型巨噬细胞、粒细胞样MDSC的比例。在第四小节的研究中,我们发现Chemerin不影响肿瘤组织中的PMN-MDSC的增殖和趋化,但是Chemerin可以显著抑制肿瘤组织中M-MDSC向PMN-MDSC的分化。综上所述,在第二部分的研究中,我们证实了Chemerin对肝癌的抑制作用并初步探究了Chemerin调节肝癌及其炎症微环境的作用机制,但是Chemerin抑制肝癌发生发展的更为详尽的调节机制还需要大量工作来进一步研究。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574.62;R735.7

【参考文献】

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本文编号：1778913