急性胰腺炎时自噬变化的意义及干扰素γ对自噬影响的实验研究

发布时间：2016-11-21 07:12

  本文关键词：急性胰腺炎时自噬变化的意义及干扰素γ对自噬影响的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

《第二军医大学》 2013年

急性胰腺炎时自噬变化的意义及干扰素γ对自噬影响的实验研究

刘晓  

【摘要】：研究背景 急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是临床常见的急症，国外报告其发病率10/105～44/105，近年来呈升高趋势。约20%患者可发展为重症急性胰腺炎，病死率高达15%～30%，病情危重，预后凶险，已经成为威胁人类健康和生命的重要杀手。尽管国内外学者对急性胰腺炎的防治进行了多年的研究，但迄今还没有针对急性胰腺炎特效的防治措施。因此，深入研究AP的发病机制，探索其启动的关键过程，不仅具有重要的学术价值，而且将有助于寻找和建立有针对性的救治方法，以期提高急性胰腺炎的救治水平，具有重要的的意义。 自噬是广泛存在于真核生物中的生命现象，属程序性细胞死亡的一种。自噬发生时，在细胞内形成“双层膜”结构的囊泡即自噬体，包裹胞质成分和某些细胞器碎片，送入溶酶体中并进行多种酶的消化及降解，为细胞内再循环提供能量和小分子物质。自噬是急性胰腺炎早期发生的事件，在急性胰腺炎中的作用机制存在很多争议。有学者采用敲除自噬相关基因小鼠研究后发现急性胰腺炎减轻，同时自噬相关蛋白减少，推测自噬在急性胰腺炎中被诱导增强，自噬对胰腺起损害作用；有学者研究发现在急性胰腺炎中长寿蛋白的降解大大减少（长寿蛋白通过自噬途径降解），大量空泡聚集，认为自噬在急性胰腺炎中下降，自噬对胰腺起保护作用；另外有学者认为自噬是一个动态的过程，自噬过程在急性胰腺炎中被破坏，自噬和胰腺炎起相互促进作用。这些相互矛盾结果显示自噬在急性胰腺炎发生中存在很大的争议。 干扰素γ是一种来自T淋巴细胞培养液上清的蛋白，，具有免疫调节和抗细胞增殖作用。目前有研究发现干扰素γ可促进自噬。另有文献报告干扰素γ对急性胰腺炎有一定影响。为了进一步探讨自噬在急性胰腺炎发生过程中的变化及其病理意义，并观察干扰素γ对急性胰腺炎及自噬的影响，并探讨其作用机制，拟开展本实验研究。 研究目标 1.建立大鼠重症急性胰腺炎模型。观察急性胰腺炎发生过程中自噬活性的变化，探讨其病理意义。 2.观察干扰素γ对急性胰腺炎炎症及自噬的影响，初步探讨其机制。 研究方法围绕上述目标，本研究采用以下研究方法： 1．动物模型的建立 采用左旋精氨酸400mg/100g（腹腔注射，2次，间隔1小时）方法，构建急性胰腺炎大鼠模型。 2．电镜 大鼠新鲜胰腺组织取下后立即置于25%戊二醛电镜固定液中，切成1mm3大小组织块，送电镜室，于透射电镜下观察自噬相关结构。 3．ELISA 造模取血，离心，上清用RD试剂盒行ELISA检测，检测不同时间点AMY、TAP的浓度及IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的水平。 4．HE染色 标本置于4％中性缓冲甲醛中固定24小时，组织脱水石蜡包埋，室温保存，行HE染色后观察胰腺炎症程度。 5．免疫组化 经漂洗，封闭，一抗和二抗孵育后检测LC3、Beclin-1、Lamp-2等蛋白在胰腺组织中的表达。 6．Western Blot 经过提取蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、曝光等步骤观察LC3、Beclin-1、Lamp-2、GAPDH等蛋白的表达。 7. qRT-PCR 通过RNA提取、逆转录和qRT-PCR的方法检测胰腺组织LC3、Beclin-1、Lamp-2、Ⅲ型PI3K、GAPDH等蛋白的基因表达。 8．统计学分析 全部数据通过SPSS11.5统计软件X进行分析，取P＜0.05具有统计学意义。计量资料实验数据以均数标准差（±S）表示；两样本均数比较采用t检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时采用LSD-t或SNK-q检验，方差不齐时采用Dunnett's T3或Dunnett's C检验。 研究结果 1．20%L-精氨酸腹腔注射可构建重症急性胰腺炎模型 先后采用250mg/100g、300mg/100g、400mg/100g和500mg/100g等不同给药剂量的20%L-精氨酸腹腔注射构建重症急性胰腺炎大鼠模型，结果发现400mg/100g的剂量腹腔注射2次，间隔1小时造模，可成功建立重症急性胰腺炎大鼠模型。 2．急性胰腺炎诱导增强自噬的发生 免疫组化、Western Blot和qRT-PCR检测发现，与正常对照组比较，大鼠急性胰腺炎模型组自噬相关因子LC3、Beclin-1的蛋白与mRNA表达显著上调；电镜观察发现急性胰腺炎组大鼠胰腺组织自噬相关超微结构明显多于对照组。结果证实急性胰腺炎可诱导增强自噬的发生。 3．调控自噬可影响胰蛋白酶原的活化程度和急性胰腺炎的损伤程度 分别采用自噬诱导剂雷帕霉素（RAP）和自噬阻断剂氯喹（CQ）及3-甲基腺嘌呤（3-MA）调控自噬活性，发现诱导自噬后TAP明显升高，阻断自噬后TAP下降；SAP9h后诱导剂组大鼠胰腺坏死病理评分高于急性胰腺炎组，阻断剂组与急性胰腺炎组无明显差别，24h后诱导剂组胰腺坏死评分高于急性胰腺炎组，阻断剂组胰腺坏死评分低于急性胰腺炎组。结果表明急性胰腺炎时自噬可促进胰蛋白酶原的激活，并参与胰腺的损伤。 4．干扰素γ在急性胰腺炎时可诱导自噬的发生及自噬体和溶酶体的融合 与急性胰腺炎对照组相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干扰素γ，免疫组化、Western Blot和qRT-PCR检测均表明自噬相关因子LC3及Beclin-1的蛋白和mRNA表达明显上调；溶酶体相关膜蛋白-2（Lamp-2）蛋白和基因表达亦明显上调。结果表明干扰素γ可进一步诱导自噬的发生，并促进自噬体和溶酶体的融合。 5．干扰素γ能促进胰蛋白酶原的激活和加重急性胰腺炎时胰腺的损伤 与急性胰腺炎对照组相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干扰素γ后胰腺水肿、炎症、坏死、出血评分明显增高；血浆炎症因子IL-6浓度明显升高，TAP在各时间点均明显上升；淀粉酶峰值前移。结果表明干扰素γ能促进胰蛋白酶原的激活，并加重急性胰腺炎时的炎症反应与胰腺损伤。 6．急性胰腺炎时干扰素γ可能通过Ⅲ型PI3K通路来诱导自噬和加重炎症 qRT-PCR显示干扰素γ组Ⅲ型PI3K复合物（vps34）mRNA明显高于急性胰腺炎对照组，提示急性胰腺炎时干扰素γ可能通过该通路诱导自噬和加重胰腺损伤和炎症。 结论 急性胰腺炎可诱导增强自噬的发生，自噬促进胰蛋白酶原的激活，并参与胰腺的损伤；急性胰腺炎时给予干扰素γ可进一步诱导自噬的发生，促进胰蛋白酶原的活化和加重胰腺的损伤，该效应可能通过Ⅲ型PI3K通路实现。

【关键词】：
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R576
【目录】：

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