FoxO1在酒精性脂肪性肝病中作用的实验研究

发布时间：2018-06-11 11:25

本文选题：酒精 + 脂肪性肝病　；参考：《河北医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是一种由于长期大量饮酒引起的中毒性肝脏疾病,肝脏病理改变最初表现为肝细胞脂肪变性,其后发展为肝炎、肝纤维化,最终出现肝硬化。酒精性脂肪性肝病(alcohol fatty liver disease,AFLD)是ALD的早期表现。课题组应用酒精灌胃建立大鼠AFLD模型,发现其发病机理主要是脂质代谢紊乱导致大量脂质沉积于肝细胞,从而引起肝细胞脂肪变性。大量研究表明叉头样转录因子O1(forkhead transcription factor O1,FoxO1)参与脂质代谢及氧化应激。FoxO1受转录后修饰(磷酸化、乙酰化、泛素化等)关联的亚细胞定位调节。定位于细胞核内的FoxO1,能结合相应的DNA序列,调控下游分子的表达。微粒体TG转运蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP)及脂联素受体2(adiponectin recpetor 2,AdipoR2)受FoxO1的调控。课题组前期发现酒精抑制沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的活性,并选择性抑制脂联素受体2(adiponectin recpetor 2,AdipoR2)的表达。Fox O1可能是SIRT1与AdipoR2连接枢纽,酒精抑制SIRT1的活性,导致FoxO1的去乙酰化减少,乙酰化增多,从而使其定位于细胞质增多、核定位减少,削弱FoxO1的DNA结合能力,减弱其转录活性,导致AdipoR2的表达减少,造成其下游一系列脂代谢过程紊乱。微粒体TG转运蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP作为FoxO1的下游蛋白,在极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的组装与分泌中起着重要作用,参与脂质向细胞外的转运。酒精引起FoxO1的转录活性减弱可能造成MTP的表达变化,导致肝细胞内脂肪沉积。研究通过酒精灌胃法建立大鼠AFLD的模型,应用分子生物学方法探讨FoxO1及其下游蛋白MTP在不同时间段的表达情况,探索FoxO1在AFLD中的作用。方法:选用健康雄性Wister大鼠50只,体重200±20g,正常饲养7天,随机分出10只为正常对照组(即0周),余40只用酒精灌胃,于第4周末随机处死大鼠10只、8周末9只、12周末8只、16周末8只;处死后立即取出肝组织,剪取部分肝组织给予10%福尔马林液固定,过夜后石蜡包埋切片,剩余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱。应用实时荧光定量聚合酶连反应(realtime-quantitativepolymerasechainreaction,rt-qpcr)检测foxo1mrna的表达,应用免疫沉淀法提取乙酰化蛋白,应用蛋白质印迹法(westernblot)检测foxo1总蛋白、乙酰化foxo1蛋白及mtp表达水平。应用免疫组化比较细胞质及细胞核内foxo1的表达情况。多组间均数比较采用单因素方差分析。结果:1肝脏组织病理学改变:应用苏丹Ⅳ染色法显示,正常对照组(0周组)未见脂肪变,随着造模时间延长,肝细胞橘红色脂滴逐渐增多,提示大鼠酒精性脂肪性肝病模型造模成功。免疫组化法检测肝细胞foxo1的表达:对照组及造模早期(4周组),foxo1的表达量少,随着造模时间的延长,foxo1表达量逐渐增多,尤其在细胞质的表达增加显著(见fig.1-5)。2rt-qpcr法检测foxo1mrna的表达:正常组大鼠肝细胞中foxo1mrna表达较少,随着酒精喂养时间的延长,foxo1mrna表达成逐渐增多趋势(见fig.7及table2)。3westrenblot法检测总foxo1蛋白的表达:正常组大鼠肝细胞中总foxo1蛋白表达较少,造模前期,总foxo1蛋白的表达量增多不明显,(0周与4周组比较p0.05,无统计学差异),8周后总foxo1蛋白量呈逐渐增多趋势(见fig.6、fig.8及table3)。4为进一步探究foxo1的活性,应用westrenblot法检测ac-foxo1蛋白的表达:正常组大鼠肝细胞中ac-foxo1蛋白表达较少,随着酒精造模时间的延长,ac-foxo1蛋白量逐渐增多,且foxo1的乙酰化水平(ac-foxo1/总foxo1)呈逐渐升高趋势(见fig.6、fig.10及table4)。5westrenblot法检测mtp蛋白的表达:正常组大鼠肝组织中表达mtp较多,随着酒精造模时间的延长,其表达量呈逐渐减少趋势(见fig.6、fig.9及table3)。结论:在大鼠酒精性肝病模型中,酒精抑制foxo1-mtp通路导致脂质在肝细胞内沉积,这可能是afld发生的重要机制之一。
[Abstract]:Objective : Liver disease ( ALD ) is a kind of medium - toxic liver disease caused by long - term drinking alcohol . The pathological changes of liver were initially characterized by fatty degeneration of hepatocytes . It was found that the pathogenesis of alcoholic fatty liver disease ( AFLD ) was the early manifestation of ALD . The expression of foxo1 was detected by means of immunohistochemistry . The expression of foxo1 was detected by immunohistochemistry . The expression of foxo1 was detected by immunohistochemistry . The expression of foxo1 was detected by immunohistochemistry . The expression of foxo1 was increased significantly ( see fig . 1 - 5 ) . In the normal group , the expression of the total foxo1 protein was significantly increased ( see fig . 6 , fig . 8 and table3 ) . In the normal group , the expression of ac - foxo1 protein was gradually increased ( see fig . 6 , fig . 10 and table3 ) . Conclusion : In the rat model of alcoholic liver disease , the inhibition of foxo1 - mtp pathway by alcohol can lead to the deposition of lipids in hepatocytes , which may be one of the important mechanisms of afld .
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5

【参考文献】