与肝纤维化发病相关的长链非编码RNAs的筛选鉴定及功能的初步研究

发布时间：2018-06-28 07:26

  本文选题：长链非编码RNA + 基因芯片　； 参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的近年来,长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)的研究成为热点。已证实,lnc RNAs通过调节基因的表达参与多种生物进程。但肝纤维化发病过程中lnc RNAs的作用尚不清楚。本研究利用基因芯片分析技术分析肝纤维化模型小鼠CCl4组和正常组中lnc RNAs的表达差异,筛选出显著差异表达的lnc RNAs,并对其功能进行初步的研究,明确了lnc RNAs在肝纤维化发病及发展过程中的作用。方法1.四氯化碳(CCl4)诱导建立小鼠肝纤维化模型:将20只SPF级雄性、8周大的balb/c小鼠随机平均分成两组,一组为实验组,连续腹腔注射CCl4六周;一组为对照组,腹腔注射橄榄油;每周2次,六周后取材。2.取两组小鼠肝组织进行Haematoxylin-eosin staining(HE染色)、天狼猩红染色、免疫组织化学染色(α-SMA和Col1α1),观察其病理学改变。3.羟脯氨酸试剂盒测定实验组和对照组小鼠组织中羟脯氨酸的含量。4.q RT-PCR和免疫荧光检测实验组和对照组小鼠肝组织中α-SMA和Col1α1的表达量。通过以上试验证明肝纤维化小鼠模型建立成功。5.各选取5只正常组和肝纤维化组小鼠的肝组织送质检,质检合格后用于芯片分析。6.对芯片结果进行分析,筛选出差异表达的lnc RNAs和m RNAs。7.根据差异分析、GO分析、pathway分析、和lnc RNA-m RNA共表达分析、临近基因分析、micro-RNA结合位点分析等筛选lnc RNAs。8.建立肝纤维化小鼠CCl4模型(balb/c和C57),并对芯片结果进行验证。9.q RT-PCR检测同一lnc RNA在不同细胞(HSC、HC和kuffer)和不同器官中的表达情况。10.Coding Potential Calculator(CPC)软件分析筛选出的lnc RNAs蛋白编码能力。11.构建包含有lnc RNAs ORF区域,且带有荧光蛋白表达基因的质粒,检测是否有荧光的表达,从而确定lnc RNAs是否具有蛋白编码功能。12.利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)扩增c DNA的5'和3'末端并测序。13.核浆分离检测lnc RNAs在胞浆和胞核中的分布情况。14.q RT-PCR检测lnc RNAs在纤维化小鼠的原代HSCs、HCs以及正常小鼠原代HSCs培养激活过程中的表达。15.TGF-β刺激小鼠原代肝星形细胞、原代肝细胞和小鼠正常肝细胞系AML12细胞,检测lnc RNAs的表达变化。16.检测肝纤维化病人组织和血液中lnc RNA的表达情况。17.对筛选出的lnc RNA分别进行敲除和过表达,检测肝纤维化相关基因的表达情况。结果1.对照组小鼠肝脏标本质地柔软、红润有光泽、体积较小;与对照组相比,实验组小鼠肝脏标本则质地变硬、色泽度下降、表面出现结节、体积变大。2.HE染色和天狼猩红染色显示,对照组小鼠肝组织标本的肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐且呈放射状;与对照组相比,实验组肝细胞排列紊乱,体积变大,胞质疏松呈现网状,肝小叶结构被破坏,且胶原沉积增多。3.羟脯氨酸测定结果显示,与对照组相比,实验组小鼠肝组织样本中羟脯氨酸含量增加到四倍左右。4.免疫组化、q RT-PCR和免疫荧光结果显示,实验组小鼠肝组织中α-SMA和Col1α1的表达量明显升高。5.对照组和实验组小鼠肝组织质检合格,用于后续芯片处理。6.芯片结果显示,与对照组相比,实验组有266 lnc RNAs和1007 m RNAs被上调,447 lnc RNAs and 519 m RNAs被下调。7.根据差异分析、GO分析、pathway分析、lnc RNA-m RNA共表达分析等筛选出10个lnc RNAs和10个m RNAs对芯片结果进行验证;然后综合临近基因分析、micro-RNA结合位点分析及其长度等,进一步筛选出一个上调(ENSMUST00000158992)和一个下调(NONMMUT045304)的lnc RNA进行后续研究。8.CCl4模型(balb/c和C57)小鼠肝组织的q RT-PCR结果与芯片一致,证明芯片结果可靠。9.q RT-PCR结果证明,NONMMUT045304在肝脏中富集,同时根据其在肝纤维化中的作用将其命名为lnc-LFAR1(Liver Fibrosis Associated lnc RNA1);而ENSMUST00000158992没有肝脏特异性;两者在HSCs、HCs和Kuffers中均表达。10.RACE结果显示ENSMUST00000158992长度为325bp,包含一个外显子,无poly A尾;lnc-LFAR1长度为734bp,包含一个外显子,且具有poly A尾。11.核浆定位证明lnc-LFAR1既存在于胞浆,又存在于胞核;ENSMUST00000158992主要存在于胞核。12.Coding Potential Calculator(CPC)软件分析显示,lnc-LFAR1包含有一个55aa的开放阅读框,缺少Kozak序列(转录起始的一个重要原件);ENSMUST00000158992包含有一个68aa的开放阅读框,缺少Kozak序列。13.荧光检测试验证明,lnc-LFAR1没有检测到绿色荧光,即无蛋白编码功能。14.在纤维化小鼠的原代HSCs和HCs,以及正常小鼠原代HSCs培养激活过程中检测到lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992的表达均显著增加。15.TGFβ处理后,lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992在正常小鼠的原代HSCs、HCs和AML12细胞中的表达量明显升高。16.ENSMUST00000158992在肝纤维化病人血液中表达显著增加。17.干扰掉lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992后,促肝纤维化相关基因被下调,且抑制TGFβ对上述基因的上调;过表达lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992的结果与干扰结果一致。结论1.CCl4诱导小鼠肝纤维化模型构建成功。2.与正常小鼠相比,纤维化小鼠肝组织中有266个lnc RNAs和1007个m RNAs上调,447个lnc RNAs和519个m RNAs下调。3.Lnc-LFAR1在肝脏中富集,且在纤维化小鼠肝脏中低表达;ENSMUST00000158992在肝纤维化小鼠肝组织中高表达。4.Lnc-LFAR1长度为734bp,包含一个外显子,且具有poly A尾,既存在于胞浆,又存在于胞核;ENSMUST00000158992长度为325bp,包含一个外显子,无poly A尾,主要存在于胞核;且两者均无蛋白编码能力。5.lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992通过促进HSCs的激活进而促进肝纤维化的发生和发展。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of expression of 伪 - SMA and Col1伪1 in liver tissue of experimental group and control group . The expression of lnc RNA in liver tissue of experimental group was increased to about four times as compared with the control group . The results showed that the expression of lnc - LF1 and ENSMUST00000158992 was significantly increased in the livers of normal mice . ENSMUST00000158992 has a length of 325bp , contains an exon , no poly A tail , is mainly present in the nucleus , and both have no protein coding ability . 5.lnc - LF1 and ENSMUST00000158992 promote the development of liver fibrosis by promoting the activation of HSCs .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2

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本文编号：2077213