可调控性uPA诱导表达系统的构建及功能鉴定

发布时间：2018-07-24 17:34

【摘要】：目的构建可调控性尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,u PA)诱导表达系统并进行相关鉴定,可为进一步构建可诱导型肝脏人源化u PA-SCID动物模型奠定基础。方法可调控性u PA诱导表达系统即在强力霉素(doxycycline,Dox)诱导下通过tet-on系统调控u PA表达。为此,需要构建两个重组质粒,分别为p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA和p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green,前者引入Gaussia荧光素酶(gaussia enzyme fluorescent element,Gluc)与四环素反式激活因子(reverse tetracycline transactivator,rt TA)偶联表达,以便于监测rt TA表达水平;后者同时偶联表达Zs Green,以便于用荧光显微镜观察基因表达。重组逆转录病毒载体进行表达功能鉴定后,将构建质粒与病毒包装衣壳蛋白VSV-G质粒共转染GP2-293包装细胞系后获得具有感染能力的病毒颗粒,利用该病毒感染NIH/3T3细胞,并用G418筛选出阳性细胞;期间各取部分细胞,使用PCR方法鉴定其基因组内是否含有相应基因转录调控本。结果成功构建p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA和p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green克隆。功能鉴定显示,p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA克隆可表达rt TA;p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green克隆转染Hep G-Tet-on细胞,加Dox可诱导u PA表达。包装病毒感染NIH/3T3细胞后通过G418筛选获得单细胞克隆,通过PCR方法鉴定表明其基因组内含有相应转录本,从而成功构建u PA诱导表达稳定细胞株。结论本研究初步建立了可调控性u PA诱导表达系统,从而为可诱导肝损的u PASCID转基因小鼠的构建及在此基础上的肝脏人源化动物模型的建立奠定了基础。
[Abstract]:Objective to construct and identify the regulated urokinase plasminogen activator (urokinase-type plasminogen activator PA) -induced expression system, which can be used as a basis for the further construction of the induced liver human U PA-SCID animal model. Methods the regulated expression system of u PA was induced by doxycycline dox (doxycycline dox). The expression of u PA was regulated by tet-on system. For this purpose, two recombinant plasmids, p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA and p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green, were constructed. The former introduced Gaussia luciferase (gaussia enzyme fluorescent element Gluc) coupled with the tetracycline transactivator (reverse tetracycline transactivator RTTA) in order to monitor the expression level of rtTA. The latter was coupled to express Zs Greenin in order to observe the gene expression by fluorescence microscope. After the expression function of the recombinant retroviral vector was identified, the constructed plasmid was co-transfected with the VSV-G plasmid of the viral capsid protein into the GP2-293 packaging cell line to obtain the viral particles with the ability to infect the NIH/3T3 cells, and the virus was used to infect the NIH/3T3 cells. The positive cells were screened by G418, and some of the cells were selected during the period, and the PCR method was used to identify whether there was a corresponding gene transcription regulator in the genome. Results the cloning of p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA and p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green was successfully constructed. Functional identification showed that ttTAP LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green clone could be transfected into Hep G-Tet-on cells by LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA clone, and UPA expression could be induced by adding Dox. Single cell clones were obtained by G418 screening after the packaging virus was infected with NIH/3T3 cells, and the corresponding transcripts were identified by PCR method, and the stable cell lines induced by UPA were successfully constructed. Conclusion the regulatory expression system of u PA was established in this study, which laid a foundation for the construction of u PASCID transgenic mice with induced liver damage and the establishment of humanized animal model of liver on this basis.
【作者单位】： 上海市公共卫生临床中心;蚌埠医学院第一附属医院;赤峰学院附属医院;复旦大学医学分子病毒学教育部卫生部重点实验室;
【基金】：国家重点基础研究发展计划(2012CB519005) 上海市科技发展基金实验动物研究项目(12140900300) 上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20144Y0073) 上海市公共卫生临床中心中心科研课题面上项目(2014M08)
【分类号】：R-332;R575

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本文编号：2142129