乙型肝炎病毒核心蛋白区变异与隐匿性乙型肝炎病毒感染的相关性研究

发布时间：2018-08-27 10:56

【摘要】：研究背景隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)是指患者血清HBsAg阴性,肝组织HBV DNA阳性(伴或不伴有血清HBV DNA阳性)。若患者血清中HBV DNA阳性,HBV低水平复制,HBV DNA200IU/ml。OBI不仅可以通过输血、器官移植和透析等方式传播HBV,而且与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关。乙型肝炎病毒核心蛋白具有多种功能,在pgRNA和pol多聚酶的衣壳化、核衣壳的解离和聚合、病毒颗粒的成熟中具有重要的作用。OBI的发生与HBV的基因突变密切相关,现有的研究主要针对HBV的S区和BCP区的变异,乙型肝炎病毒核心蛋白区(C区)变异在OBI的发生发展中的作用机制目前仍不清楚。研究目的探索乙型肝炎病毒核心蛋白区(C区)变异在隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)中的作用。研究方法本研究通过重叠延伸PCR和定点突变PCR技术构建含有不同突变位的乙型肝炎病毒核心蛋白区突变型质粒,通过细胞免疫荧光检测肝组织HBcAg的分布情况,western blot检测HBcAg表达水平,化学发光法检测HBsAg和HBeAg的表达水平,免疫组织化学检测小鼠肝组织HBcAg的表达情况,RT-PCR检测小鼠肝组织中HBV RNA的水平。实验结果利用重叠PCR和定点突变技术成功构建单点、双联和三联突变的OBI毒株和野生株。HBcAg在HuH7细胞有三种不同分布类型。A类包括wt、SZB、SZA-R62W、wt-P50H、wt-L55I、wt-W62R、wt-S74G、wt-S87G、wt-L95I、wt-I97L、wt-T142M、wt-T147A、SZA-H50P/R62W、SZA-P50H/R62W/G74S、SZA-R62W/G74S、wt-P50H/L95I;B 类包括 SZA、SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T;C 类包括 wt-P50H/W62R、wt-P50H/W62R/S74G、wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A、wt-W62R/L95I。OBI 毒株 SZA、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T、wt-P50H/W62R/S74G 的 HBcAg 表达水平低于野毒株,SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L 的 HBcAg 表达水平高于 SZA 的 HBcAg 表达水平。OBI毒株SZA和SZB胞内和胞外HBeAg水平低于野毒株。OBI毒株SZA的 5 个单点回复突变 SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L可轻度提高胞内和胞外HBeAg水平,SZA的4个单点回复突变SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T对其无明显影响。SZA的双联和三联回复突变的HBeAg表达水平要高于单点回复突变。野毒株的单点突变wt-P50H和wt-W62R 可降低 HBeAg 水平,而双联突变 wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I,三联突变 wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A 的 HBeAg 表达水平低于野生型的单点突变。OBI毒株SZA在Balb/c小鼠肝组织不表达HBcAg,SZB在肝组织表达HBcAg。野毒株在肝组织表达HBcAg,分布类型为Ⅲ型。OBI毒株SZA的8个单点回复突变 SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T不表达HBcAg。单点回复突变SZA-R62W,双联回复突变 SZA-H50P/R62W、SZA-R62W/G74S,三联回复突变 SZA-P50H/R62W/G74S可提高HBcAg的表达水平。野毒株的单点、双联、三联突变不影响HBcAg的表达水平。Balb/c小鼠血清中,OBI毒株SZA的8个单点回复突变SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T的HBeAg表达水平差异不明显,SZA的单点回复突变SZA-R62W能显著提高HBeAg的表达水平。野毒株的单点突变wt-P50H、wt-W62R,双联突变 wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I,三联突变 wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A的HBeAg表达水平低于野毒株其它位点的单点突变。第1周和第7周,SZA在小鼠肝组织始终不表达HBcAg。第1周,wt在小鼠肝脏中表达HBcAg,并且在第7周HBcAg的表达水平明显上升。第1周,小鼠肝脏中SZA的HBV total RNA和C region RNA水平均低于野毒株。第七周,小鼠肝脏中SZA的HBV total RNA和C region RNA均高于野毒株。OBI毒株SZA的HBeAg长期处于低表达水平(10-15 S/CO)。野毒株HBeAg长期处于高表达水平(500-1500 S/CO)。OBI毒株的C区的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的联合变异改变HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表达水平,其中W62R起着最关键的作用。乙性肝炎病毒C区变异对OBI的形成具有重要作用。结论OBI毒株的C区的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的联合变异改变HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表达水平,其中W62R起着最关键的作用。乙性肝炎病毒C区变异对OBI的形成具有重要作用。
[Abstract]:BACKGROUND Occult hepatitis B virus infection (OBI) refers to a patient with negative serum HBsAg and positive liver tissue HBV DNA (with or without serum HBV DNA positive). If the patient's serum HBV DNA positive, HBV DNA replication at low levels, HBV DNA 200IU/ml. OBI can not only be achieved by blood transfusion, organ transplantation and dialysis. Hepatitis B virus core protein has many functions. It plays an important role in the capsification of pgRNA and pol polymerase, the dissociation and polymerization of nucleocapsid and the maturation of viral particles. OBI is closely related to the mutation of HBV gene. Current studies mainly focus on HB. The mechanism of HBV core protein region (C) mutation in the occurrence and development of OBI is still unclear. Objective To explore the role of HBV core protein region (C) mutation in occult hepatitis B virus infection (OBI). The mutant plasmids containing different mutation sites of hepatitis B virus core protein region were constructed by mutant PCR. The distribution of HBcAg in liver tissues was detected by immunofluorescence, the expression of HBcAg was detected by Western blot, the expression of HBsAg and HBeAg was detected by chemiluminescence, and the expression of HBcAg in liver tissues of mice was detected by immunohistochemistry. HBcAg in HuH7 cells can be divided into three types: wt, SZB, SZA-R62W, wt-P50H, wt-L55I, wt-W62R, wt-S74G, wt-S87G, wt-L95I, wt-I97L, wt-T142M, w-L55I. t-T147A,SZA-H50P/R62W,SZA-P50H/R62W/G74S,SZA-R62W/G74S,wt-P50H/L95I;B 绫诲寘鎷，

本文编号：2207064