外周血单个核细胞和肝组织内雄激素受体和雌激素受体α与慢性乙型肝炎发病和进展的相关性

发布时间：2018-10-16 10:48

【摘要】：目的：研究外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)内和肝组织内雄激素受体(androgen receptor, AR)和雌激素受体a (estrogen receptor a, ERa)表达水平与慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者肝组织病理状态、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)病毒复制及其抗原表达水平、CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)/辅助性T细胞17 (T helper cell 17,Th17)的相关性。资料与方法：1研究对象：1.1 入选标准：参照2010年中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中的诊断标准,按照住院时间选取经过肝穿刺活检的CHB患者94例,性别、年龄不限。1.2排除标准：1)既往经过抗病毒治疗的患者；2)合并酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、丙型肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝病、胆汁淤积性肝病、淤血性肝病、肝豆状核变性、血色病及其他病毒性肝炎的患者；3)近半年内曾经使用激素、或激素替代药物、或激素拮抗药物、或甘草酸类药物、或抗肝纤维化药物的患者；4)肝硬化失代偿期患者；5)性腺疾病、内分泌与其他可能影响体内睾酮、雌二醇疾病的患者。2标本的留取2.1PBMCs分离：Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs,分离的细胞分成两份,一份加入lml冻存液,另一份加入300此的RNAlater,-80℃冰箱冻存。2.2肝组织标本留取：肝组织活检采用1秒钟经皮肝穿刺法,抽取肝组织长度≥1.2cm；肝组织标本采集后分成两段,长度分别≥1.0cm和0.2cm,分别送病理送检和用RNAlater浸没放入-80℃冰箱冻存。3实验方法3.1 PBMCs中Th17及Treg频率：用流式细胞仪检测Thl7细胞频率(CD3+CD8-IL17+)及Treg细胞频率(CD3+CD8-CD25+CD127-).3.2 PBMCs内和肝组织内AR mRNA、ERamRNA、叉状／翅状螺旋转录因子3 (forkhead/winged helix transcription factor3, Foxp3)mRNA、维甲酸相关孤儿受体γt (retinoic acid related orphan receptor yt, RORyt) mRNA含量测定：采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)测定。3.3肝组织内Foxp3+和IL-17+T细胞检测：用免疫组化法(immunohisto-chemistry, IHC),并随机挑取5个汇管区进行Foxp3+和IL-17+T计数,取其平均数。3.4肝组织病理学诊断：苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色和网状纤维染色(masson staining),资深病理科医师进行组织病理学分级(grading,G)和分期(staging, S)。3.5肝组织HBsAg和HBcAg表达：用IHC测定。3.6血清乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)标记物及HBsAg定量检测：采用化学发光微粒子免疫检测法检测。3.7血清HBV DNA定量检测：采用RT-PCR测定。结果：1 HBeAg阳性患者,PBMCs内ERa mRNA含量与分级呈显著正相关(r=0.303,P=0.034)；肝组织内AR mRNA含量与肝组织分级与分期均呈显著负相关(r=-0.432, P=0.002; r=-0.353, P=0.014)。HBeAg阴性患者,PBMCs内AR mRNA含量与肝组织分级与分期均呈显著负相关(r=-0.362, P=0.019; r=-0.346, P=0.025),肝组织内AR mRNA含量与肝组织分级与分期均呈显著负相关(r=-0.592, P=0.000; r=-0.472, P=0.001)。2无论HBeAg阳性或HBeAg阴性患者,PBMCs及肝组织内AR mRNA和ER mRNA含量与肝脏HBsAg水平和HBcAg水平、血清HBsAg水平和HBVDNA载量之间均无显著相关性(P0.05)。3 HBeAg阳性患者, PBMCs内ERa mRNA含量与PBMCs内Foxp3 mRNA、 RORyt mRNA含量之间均呈显著正相关(r=0.557, P=0.000; r=0.610, P=0.000),肝组织内ERa mRNA含量与肝组织内RORyt mRNA、RORyt mRNA/Foxp3 mRNA含量之间均呈显著正相关(r=0.550, P=0.000; r=0.485, P=0.000)。HBeAg阴性患者,PBMCs内ERa mRNA含量与PBMCs内Foxp3 mRNA、RORyt mRNA含量之间均呈显著正相关(r=0.478, P=0.001; r=0.585, P=0.000),肝组织内ARmRNA含量与肝组织内RORyt mRNA含量之间呈显著负相关(r=-0.371,P=-0.013),肝组织内ERa mRNA含量与PBMCs内RORyt mRNA、RORyt mRNA/Foxp3 mRNA含量之间均呈显著负相关(r=-0.509, P=0.001; r=-0.336,P=0.030),与肝组织内RORyt mRNA含量之间呈显著正相关(r=0.407,P=0.006)。4 HBeAg阳性患者,PBMCs内Foxp3 mRNA含量与肝组织分级分期均呈显著正相关(r=0.448, P=0.001; r=0.322, P=0.024); PBMCs内RORyt mRNA含量与肝组织分级呈显著正相关(r=0.342,P=0.016),肝组织内RORyt mRNA/Foxp3 mRNA含量与病理分级和分期均呈显著负相关(r=-0.649, P= 0.000; r=-0.568, P=0.000)。HBeAg阴性患者,肝组织内Foxp3 mRNA含量与肝组织分级呈显著正相关(r=0.348,P=0.021),肝组织内RORγt mRNA含量与肝组织分级和分期均呈显著正相关(r=0.410,P=0.006;r=0.381,P=0.011).结论：1 AR和ERα对CHB发病和进展的影响在HBeAg阳性患者和阴性患者之间可能有所不同；但不管是HBeAg阳性还是阴性患者,肝组织内AR mRNA表达的减少可能是影响CHB发病和进展的独立的危险因素。Treg细胞和Th17细胞也可能与CHB发病和进展密切相关。2 AR和ERα影响CHB发病和进展的机制可能并不是主要依赖于影响HBV的复制和抗原表达,其机制可能是依赖于影响Treg细胞和Th17细胞的活化和生成。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.62

【参考文献】