丙型肝炎病毒核心蛋白通过转录因子Snail下调E-cadherin表达的分子机制研究

发布时间：2018-10-19 10:56

【摘要】：目的：原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是威胁人类健康最严重的恶性肿瘤之一，导致肝癌发生的原因很多。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是导致HCC发生的重要危险因素。全球约有1.7亿人感染HCV，其中80%的成年患者将发展成慢性丙型病毒性肝炎，进而进展为肝纤维化，肝硬化甚至肝癌。原发性肝癌病死率高，其中一个主要原因是肿瘤恶性程度高，较早发生转移。目前许多实验支持HCV编码的蛋白，尤其是核心蛋白在HCV相关肝脏疾病的发生过程中发挥主要的作用，同时还参与HCC的恶性转移过程，但其具体机制不明。上皮样细胞向间质样细胞转化（EMT）的过程是上皮细胞受到刺激后，失去粘着蛋白（E-cadherin）对细胞之间的紧密连接，上皮细胞基底膜极性被破坏，细胞之间变得疏松，并进一步获得间质样细胞特有的应力纤维（fibronectin）、波形蛋白（vimentin），，细胞最终具有迁移、侵袭及转移的能力。以往研究者对EMT的认识多集中在胚胎发育期，即EMT在正常的胚胎发育过程中发挥重要作用，例如EMT参与中胚层、心脏发育及神经嵴的形成。近年来EMT参与肿瘤的转移和侵袭得到广泛关注，有研究报道显示，在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌以及黑色素瘤中发现EMT参与肿瘤的迁移、侵袭及转移。但是EMT参与HCV感染相关的原发性肝癌恶性转移过程的具体机制仍不清楚。发生上皮样细胞向间质样细胞转变（EMT）的细胞表型改变主要包括：细胞迁移能力、侵袭能力增强，细胞凋亡受到抑制。EMT的典型分子标志物包括：上皮细胞标志物E-cadherin表达下调，间质细胞重要指标vimentin，N-cadherin，fibronectin表达增加，β-catenin出现核转位；与此同时调控E-cadherin表达的抑制性转录因子表达上调，如Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、E47等。粘着蛋白E-cadherin是构成细胞间紧密连接的功能蛋白。当缺失E-cadherin时，细胞的侵袭、转移能力都显著增加，而回复肿瘤细胞中E-cadherin表达，发现细胞表现为上皮表型，同时细胞的迁移能力降低；除此之外，异位表达的E-cadherin，可以使间质细胞特异表达基因的转录受阻。因此，E-cadherin的表达缺失被视为EMT发生的重要标志。研究显示SNAIL转录因子超家族Snail通过识别保守的5’-CAGGTG-3’序列，直接与E-cadherin(CDH1)启动区上的E-box结合，负性调控CDH1启动子活性，进而抑制E-cadherin的表达。最新研究表明，肝癌组织中E-cadherin的低表达与Snail负相关，肿瘤组织中高表达Snail，肝癌的侵袭和转移率高，患者预后较差。课题组前期实验表明：体外肝癌细胞模型中HCV核心蛋白能够下调E-cadherin的表达，但是HCV核心蛋白能否通过转录因子Snail下调E-cadherin表达，从而促进肝癌细胞的迁移、侵袭及转移，目前还未见报道。本研究旨在进一步探讨核心蛋白调控E-cadherin表达的分子机制及参与肝癌发生恶性转移的作用。方法：采用细胞划痕、迁移实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光及siRNA干扰技术验证HCV核心蛋白诱导肝癌细胞由上皮样细胞向间质样细胞的转化，分析HCV核心蛋白诱导EMT进程的相关信号通路。进一步采用基因重组技术构建E-cadherin(CDH1)启动子区报告质粒及CDH1启动子区E-box突变报告质粒，分析HCV核心蛋白对CDH1启动子活性的调控作用；通过染色质免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation, ChIP）、免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）方法研究核心蛋白调控CDH1基因的分子机制。体内实验通过裸鼠肝癌皮下移植瘤模型和肝脏原位移植瘤模型，研究HCV核心蛋白对肝癌细胞增殖和侵袭、转移能力的影响。进一步采用HE染色和免疫组化方法检测裸鼠肝脏原位移植瘤模型中Core、Snail、E-cadherin以及侵袭相关分子VEGF，MMP-2，MMP-9的表达。结果：在瞬时或稳定表达HCV核心蛋白的Huh7细胞中， HCVCore下调上皮细胞重要标志物E-cadherin，增强间质细胞标志物vimentin的表达，引起肝癌细胞EMT的发生，此现象同时在HCV体外复制模型中得到验证。核心蛋白过表达的Huh7细胞中，回复E-cadherin的表达可以部分阻断HCV Core诱导肝癌细胞EMT的发生，说明HCV Core诱导肝癌细胞EMT的发生与细胞中E-cadherin的缺失表达密切相关。进一步研究HCV Core诱导EMT发生的相关信号通路发现，HCV Core对调控EMT常见信号通路TGF-β无明显激活作用，其通过激活Akt/GSK-3β信号通路，增加Snail的稳定性，从而抑制E-cadherin的表达，引起肝癌细胞EMT的发生。 HCV Core介导Snail结合于CDH1启动子区的E-box1（-80~-75），E-box3（-30~-25），E-box4（+22~+27），抑制CDH1的启动子活性，其中发挥主要负性调控作用的是E-box1、3，并且两者之间具有协同作用。深入分析发现：HCV Core可以增强Snail结合于CDH1启动子区，同时Core还可以与Snail形成复合物，共同结合于CDH1启动子区，抑制E-cadherin的表达。因此，在过表达核心蛋白的Huh7细胞中证实：HCV Core能与Snail直接结合，形成转录抑制复合物，抑制E-cadherin的转录。裸鼠肝癌皮下移植瘤模型发现：HCV Core通过稳定Snail，下调E-cadherin的表达，增强MMP-2、MMP-9、VEGF等的表达，促进异位移植瘤的生长，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。肝脏原位移植瘤模型实验结果表明：HCV Core能诱导肝癌细胞在肝内发生广泛性转移，部分裸鼠发生肺部的远处转移。采用siRNA技术特异沉默Snail表达，可以明显降低HCV Core诱导的肝内转移和肺转移。E-cadherin的表达明显回复，MMP-2、MMP-9以及VEGF表达显著下调。体内皮下移植瘤模型和肝脏原位移植瘤模型的结果证实：HCV Core增强肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而沉默Snail的表达可以明显抑制Core促肿瘤增殖与迁移效应，充分说明Core促肿瘤效应依赖转录因子Snail的参与。结论：我们通过体外和体内实验证实HCV Core通过激活Akt/GSK-3β信号通路稳定转录因子Snail，从而下调上皮细胞标志物E-cadherin的表达，促进HCV感染相关肝癌细胞EMT进程。从正反两方面证实HCV Core通过与Snail结合形成转录抑制复合物，下调E-cadherin的表达，参与HCV诱导EMT进程的一种新的分子机制，揭示了Core促肿瘤效应依赖于转录因子Snail的参与，为阐明HCV感染相关肝癌的发生发展提供了新的理论依据，为HCV感染相关肝癌的靶向治疗奠定了重要的基础。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.63;R735.7

【参考文献】