二乙基亚硝胺（DEN）诱导斑马鱼肝纤维化模型的建立、初步机制探讨以及利用CRISPR-Cas9系统构建斑马鱼突变体

发布时间：2018-11-11 13:58

【摘要】：研究背景肝纤维化是由各种致病因子所致肝内结缔组织合成分泌异常增多,导致肝内弥漫性细胞外基质(fibrillar extracellular matrix, ECM)过度沉积的持续性病理改变过程,也是多种肝脏疾病向肝硬化甚至肝癌等进一步发展的重要中间环节。据报道,我国肝硬化的发病率约为同时期住院患者总数的1%,占所有死亡原因的第六位,对社会医疗保健事业影响重大。基础及临床研究已经证实,肝纤维化是一个可逆过程。尽管早期诊断并及时干预原发病所致的肝脏炎症性坏死,可在一定程度上防止肝纤维化的发展,但目前尚无疗效肯定的直接抗肝纤维化药物。因此,为更好地研究肝纤维化的发生机制、探索相关药物在治疗肝纤维化时的合理给药途径并验证其疗效,建立稳定可靠的肝纤维化动物模型具有重要意义。传统的肝纤维化模型一般以小鼠、大鼠或家兔为实验动物,所建立的肝纤维化模型包括中毒性肝损伤模型、胆汁淤积性肝损伤模型、免疫性肝损伤模型及转基因动物模型等。与传统实验动物相比,斑马鱼具有饲养管理经济方便、繁殖周期短、产卵量大、样本获取简便、分子遗传操作简单易行等优点,很好地弥补了传统动物模型实验耗费高、样本量相对局限、建模操作复杂等不足。基于物种自身特点,中毒性肝损伤法和转基因法在诱导建立斑马鱼肝纤维化模型时具备更强的可行性。而相较于转基因法,药物诱导建立肝纤维化模型的方法技术难度较小、实验周期短。二乙基亚硝胺(DEN)是一种具有细胞毒性的致癌剂,具有明显的肝脏亲和性。DEN经微粒体转化后,可引起核酸和蛋白质等大分子甲基化,导致肝细胞坏死,刺激肝内ECM的合成与分泌,从而促进纤维化的形成。此外,DEN为水溶性物质,在室温下理化性质较稳定,符合建立斑马鱼模型的药物条件且能够采用直接浸泡的方式给药。因此,本研究采用DEN肝毒性药物诱导斑马鱼肝脏纤维化的形成。ECM的过度沉积是肝纤维化形成的基础,当肝脏受到外源性刺激损伤时,肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝内ECM合成与分泌的主要细胞。由于斑马鱼体型小,肝脏组织细胞含量少,斑马鱼HSCs原代分离技术难度高,因此,在细胞水平研究野生型斑马鱼肝纤维化的发病机制不易实现。本课题组前期研究发现,嘌呤信号通路和内质网应激(ER stress)与斑马鱼肝脏疾病的发生存在密切关系,且报道显示嘌呤信号通路和ER stress参与调控肝纤维化的疾病进展。因此,本研究拟利用Real-time RT-PCR方法检测上述信号通路相关基因的表达水平,从而初步探讨斑马鱼肝纤维化的发病机制。CRISPR-Cas9系统是一种由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的技术,能够诱导DNA损伤,并在DNA靶位点产生DNA双链断裂(Double strand breaks, DSBs)。 DSBs能够激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologous end-ing-joining, NHEJ)或同源重组(Homologous recom-bination, HR)两种修复机制,从而实现基因组定点编辑。目前,该技术已成功应用于人类细胞、细菌、植物以及斑马鱼等生物的遗传学改造。根据斑马鱼肝纤维化发病机制的初步探讨结果,本研究利用CRISPR-Cas9系统对参与斑马鱼肝纤维化形成的关键基因进行基因组定点修饰,尝试构建关键基因敲除的斑马鱼突变体,从而探讨相关基因缺失对DEN诱导斑马鱼肝纤维化疾病的影响,这将为抗纤维化靶向新药的研发提供稳定可靠的模式生物奠定实验基础。目的尝试利用DEN致中毒性肝损伤的方法构建斑马鱼肝纤维化模型,并评估该模型的可行性与稳定性。分别由嘌呤信号通路和内质网应激入手,初步探讨斑马鱼肝纤维化的发生机制。采用CRISPR-Cas9系统对相关通路中关键基因进行定点修饰,探讨关键基因缺失对斑马鱼肝纤维化的影响,为深入探讨肝纤维化的发病机制、寻找切实有效的抗纤维化药物提供新的研究思路与方向。材料与方法1、实验动物3月龄健康AB品系野生型(Wild-type AB strain)斑马鱼(Danio rerio),由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室惠赠。按照Westerfield方法养殖斑马鱼,光照周期维持时间为L:D=14h:10h,温度控制在28.5℃C。2、斑马鱼二乙基亚硝胺(DEN)处理将斑马鱼随机分为DEN处理组及对照组(60条／组),分别饲养于不同的鱼缸中。DEN处理组于饲养缸中直接投放药物,每2周更换缸内液体1次,并于浸泡后第2、4、6周末分别随机选取各组斑马鱼(20条／组)检测相关指标以评估肝纤维化病变的进展。3、斑马鱼身长、体重、体重质量指数(BMI)和肝脏指数的检测分别于造模2、4、6周末测量斑马鱼身长(cm)和体重(g),在显微镜下迅速解剖分离其肝脏组织,并称量肝组织湿重(g),计算BMI及肝脏指数。4、肝脏组织病理切片4%多聚甲醛固定斑马鱼5天,不同浓度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡后包埋,4μm切片,行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)、Gomori氏网状纤维以及天狼星红苦味酸病理染色,Olympus BX51光镜下观察肝脏组织病理学变化。5、Real time RT-PCR方法检测基因表达水平Trizol法提取斑马鱼肝脏RNA,利用紫外分光光度法(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, USA)测定RNA浓度及纯度；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA)试剂盒反转录合成cDNA; Real time RT-PCR反应采用LightCycler(?)Nano进行检测。6、CRISPR-Cas9系统构建斑马鱼突变体根据基因组序列设计sgRNA;以pXT7-hcas9载体为模板体外转录Cas9mRNA (T7 mMESSAGE mMACHINE(?) Kit, Ambion);将Cas9 mRNA与sgRNA按一定的比例预混(300ng/ul～500ng/ul;100ng/ul～300ng/ul),收集单细胞受精卵用于显微注射,于注射24小时利用酶切法检测靶点突变效率,选取突变效率和存活率较高的同批次注射F0胚胎饲养至性成熟,用于检测、筛选F0生殖细胞遗传性。将具有潜在突变的F0与WT斑马鱼外交获得F1代胚胎,将其饲养至性成熟后酶切法和测序检测F1突变类型。7、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。考虑到DEN处理和处理时间两个因素的作用,在分析DEN对基因表达的影响时采用双向方差分析(two-way ANOVA)检验,各组均数多重比较采用LSD法(least-significant difference test);若方差不齐,多重比较采用Dunnett's T3法；两组间比较采用两个独立样本t检验。用Sigmaplot10.0软件作图。P0.05表示差异具有统计学意义。结果1、DEN处理后斑马鱼的一般情况与对照组相比,DEN处理组斑马鱼在药物诱导后第1周内,食欲明显减退,游动减少,第2周起食欲逐渐增加,游动亦增多,考虑系斑马鱼对DEN逐渐耐受所致。实验过程中,DEN处理组与对照组斑马鱼体表、鱼腮等处鳞片光滑,均未见立鳞、烂鳃、出血以及溃疡等形态学异常。2、DEN处理后斑马鱼的生长发育情况分别在造模2周、4周和6周末检测斑马鱼身长、体重、BMI以及肝指数,结果显示,斑马鱼身长和肝指数在DEN处理组与对照组间未见明显差异；体重和BMI在6周造模结束时处理组斑马鱼较对照组明显减轻(P0.05)。结果提示随着DEN处理时间的延长,斑马鱼生长发育受限。3、DEN对斑马鱼肝组织病理形态学的影响光镜下观察肝脏组织病理形态学改变,结果显示造模期间对照组斑马鱼肝脏组织结构完整,肝细胞排列整齐,未见肝炎、纤维结缔组织异常增多等病理改变；DEN处理组斑马鱼于2周末肝脏轻度炎症反应,炎性细胞少量浸润,未见明显增生的纤维组织；4周末肝细胞变性坏死,局部可见坏死灶,网状纤维合成分泌增多,未见胶原纤维异常增多；6周末肝脏结构紊乱,纤维结节形成,网状纤维和胶原纤维过度沉积。提示斑马鱼肝纤维化形成早期以网状纤维合成分泌为主,随着疾病进展胶原纤维也逐渐增多。4、斑马鱼肝脏炎症反应和肝纤维化的发生率随着DEN处理时间延长,斑马鱼肝脏炎症反应发生率分别为60%(2周)、80%(4周)及100%(6周),肝纤维化的发生率则由30%(4周)增加到80%(6周),提示DEN对斑马鱼肝脏损伤严重程度具有时间依赖性。5、斑马鱼肝纤维化相关指标的表达情况利用Real-time RT-PCR方法检测肝纤维化相关基因Acta2、Collα1、TGF-β、 MMP9和TIMP1 mRNA的表达水平,结果显示造模期间处理组Acta2、Collα1、 TGF-β、MMP9和TIMP1 mRNA均较对照组表达上调,差异具有统计学意义(P0.05),进一步证明采用DEN诱导斑马鱼肝纤维化的建模方法效果稳定可靠。6、斑马鱼肝纤维化发病机制的初步探讨结果利用Real-time RT-PCR方法检测嘌呤信号通路、ER stress及其介导的凋亡和自噬途径相关基因的表达水平,结果显示,腺苷生成关键酶CD73参与斑马鱼肝纤维化的形成；而腺苷受体A1、A2aa、A2ab和A2b的表达水平在DEN处理组和对照组间未见明显差异。结果提示CD73调控斑马鱼肝纤维化的疾病进展可能与嘌呤信号通路无关。此外,ER stress也参与其中,DEN处理组ER stress相关基因BiP/GRP78、 PERK、ATF6、IRE1和CHOP的mRNA表达水平均较对照组表达上调(P0.05)。进一步检测ER stress介导的凋亡和自噬途径相关基因的表达,结果显示凋亡家族分子Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表达水平在两组间未见明显差异,且抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表达水平在处理组中较对照组明显上调,提示凋亡途径可能不参与调控斑马鱼肝纤维化的疾病发生；而自噬相关基因Atg3、Atgl2和Beclin1的nRNA表达水平在处理组中较对照组表达明显上调(P0.05)。结果提示ER stress介导的自噬途径可能参与调控斑马鱼肝纤维化的形成。7、CRISPR/Cas9系统构建斑马鱼BiP/GRP78和CD73突变体基于斑马鱼肝纤维化发病机制的初步研究,目前本研究利用CRISPR/Cas9系统对斑马鱼形成的关键基因CD73和BiP/GRP78进行定点修饰,并采用酶切法检测突变效率,结果显示BiP/GRP78靶点(GGTCGAAGTCTTCTCCGCCC)无突变效率；CD73靶点(GGACGCAGGAGACCAGTTCC)突变效率最高约为20%,然而该靶点相应的FO未发现生殖细胞具有遗传性；CD73靶点(GGTGGATCTCCGCGACACTC)突变效率最高约为50%,且FO生殖细胞具有遗传性,将相应的子代F1饲养长大后利用酶切法和测序鉴定其突变类型。结论1、利用DEN诱导斑马鱼肝纤维化的建模方法效果稳定可靠,该方法所建立的斑马鱼肝纤维化模型可为肝纤维化发病机制的研究以及相应治疗药物的筛选提供稳定的实验基础。2、发现腺苷生成关键酶CD73以及ER stress介导的自噬途径可能参与调控斑马鱼肝纤维化的疾病进展,为深入探讨肝纤维化的发病机制提供了新的思路和方向。3、利用CRISPR/Cas9系统已经成功获得生殖细胞可遗传的CD73 F0代斑马鱼,潜在具有突变效率的CD73 F1代斑马鱼正在饲养。CRISPR/Cas9系统的成功应用将为肝纤维化靶向新药的研发提供遗传背景稳定可靠的模式生物。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2;R-332

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