siRNA沉默X-盒结合蛋白1对急性胰腺炎腺泡细胞TNF-α、IL-6的影响

发布时间：2018-12-18 00:17

【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床常见的危重疾病,起病急骤,病情发展迅速,病死率较高。除了胰腺本身病变外,还可以引起胰腺外组织和器官的损伤,甚至诱发全身炎症反应综合症和多器官功能障碍综合征而导致死亡。尽管在过去的几十年里急性胰腺炎的研究取得明显进展,但是其发病机制仍较复杂。随着近几年来细胞分子生物学等方面的深入研究,胰腺腺泡细胞损伤的细胞生物学机制取得较大进展,其中内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)引起广泛关注。X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)是与内质网中蛋白质折叠有关的蛋白质。XBP1在调节内质网应激反应及维持成熟腺泡细胞生存力中起到直接重要作用,其表达上调常用于ERS的标志。大量研究已表明XBP1与糖尿病、肿瘤、炎症性疾病、病毒感染、心血管疾病、中枢神经系统疾病等多种人类疾病的发生、发展密切相关。但是目前XBP1与胰腺炎关系的研究较少,故本研究拟初步探讨siRNA沉默XBP1对急性胰腺炎腺泡细胞TNF-α、IL-6的影响。目的:本研究通过雨蛙素或雨蛙素联合脂多糖作用于沉默XBP1基因的AR42J细胞获得不同程度的胰腺炎模型。并通过监测细胞培养液中淀粉酶(amylase,AMY)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,初步探讨siRNA沉默XBP1对急性胰腺炎腺泡细胞TNF-α、IL-6的影响。方法:1获得XBP1基因沉默的AR42J细胞:用荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)转染细胞,通过荧光显微镜筛选出siRNA转染的最适浓度。在与XBP1沉默相关的三条siRNA中,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)筛选出沉默效果最佳的siRNA。2制造模型:将AR42J细胞随机分为转染组和未转染组。转染组:用沉默效果最佳的siRNA转染AR42J细胞,后将细胞分为三组:雨蛙素组(CAE组)、雨蛙素+脂多糖组(CAE+LPS组)、对照组(control组)。cae组给予10-7mol/l雨蛙素,cae+lps组组给予10-7mol/l雨蛙素+10mg/l脂多糖,control组给予等体积完全培养基。分别于4h、8h、24h三个时间点收集各组细胞上清液。未转染组:将未转染的ar42j细胞分为三组:cae组、cae+lps组、control组。干预方法同上。3实验方法:采用rt-pcr观察ar42j细胞中转染效果。应用淀粉酶试剂盒检测细胞上清中淀粉酶(amylase,amy)水平,利用elisa(enzymelinkedimmunosorbentassay)方法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)及白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)水平。4统计学方法:应用spss13.0软件包进行统计学处理,p0.05认为具有统计学意义。结果:1用不同sirna转染细胞,为筛选沉默效果最佳的sirna行荧光定量pcr检测xbp1mrna表达,结果显示:xbp1-303组、xbp1-684组、xbp1-808组与空白组比较xbp1mrna表达水平较低,有统计学差异(p0.05),其中xbp1-303组xbp1mrna表达水平显著下降。阴性对照组、lipo组与空白组比较xbp1mrna表达水平间无统计学差异。2细胞培养上清amy:未转染组与转染组两组组内比较:在各时间点,control组细胞上清amy水平较低且无显著变化;与之相比,cae组及cae+lps组amy水平均显著升高(p0.05),且随时间延长而逐渐上升在8h达最高水平;与cae组相比,cae+lps组各时间点血清amy水平则明显上升(p0.05)。两组组间比较:除control组各时间点amy水平无统计学差异外,cae组及cae+lps组各时间点amy水平转染组较未转染组均明显升高(p0.05)。3细胞培养上清tnf-α:未转染组与转染组两组组内比较:control组细胞上清tnf-α水平在各时间点均较低;cae组及cae+lps组分别与control组比较,各时间点tnf-α均显著升高(p0.05),且随时间延长而逐渐上升;cae+lps组与cae组相比,在各时间点血清tnf-α水平均明显上升(p0.05)。两组组间比较:在各时间点,control组tnf-α水平无统计学学差异,cae组及cae+lps组tnf-α水平转染组较未转染组均明显升高(P0.05)。4细胞培养上清IL-6:未转染组与转染组两组组内比较:在各时间点,Control组细胞上清IL-6水平均无显著变化,且较低;CAE组及CAE+LPS组各时间点IL-6水平均随时间延长而逐渐上升,且较Control组显著升高(P0.05);在各时间点与CAE组相比,CAE+LPS组细胞培养上清IL-6水平均明显上升(P0.05)。两组组间比较:Control组各时间点IL-6水平无显著变化,CAE组及CAE+LPS组各时间点IL-6水平转染组较未转染组均明显升高(P0.05)。结论:1应用雨蛙素及雨蛙素联合脂多糖可成功复制AP和SAP体外模型,为研究XBP1在急性胰腺炎炎症反应中的作用提供了条件。2在AP细胞模型中TNF-α、IL-6水平明显增高,它们作为关键性的炎症因子,在AP发生发展中起重要作用。3沉默XBP1后急性胰腺炎胰腺腺泡细胞产生AMY升高,同时伴随TNF-α、IL-6水平明显升高,表明XBP1参与了急性胰腺炎的发生,可能通过减少细胞因子TNF-α、IL-6的产生而发挥保护作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576

【参考文献】