眼镜蛇毒神经生长因子诱导肝星状细胞凋亡中的差异蛋白质表达及验证

发布时间：2019-01-10 20:45

【摘要】：目的：从眼镜蛇毒中分离出具有生物学活性的蛇毒神经生长因子（Nervegrowthfactor，NGF），分析蛇毒NGF对肝星状细胞（Hepaticstellatecells，HSC）凋亡、增殖及蛋白质表达的影响，从细胞和蛋白组学水平探讨蛇毒NGF抗纤维化作用的机理。实验方法：根据实验目的不同设计的分组实验方法具体如下：（1）贴壁细胞的MTT实验分组：用单纯培养基培养的细胞设为空白对照组，用眼镜蛇毒神经生长因子进行干预（干预浓度依次为1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）的细胞设为实验组；（2）流式细胞术实验分组：用单纯培养基培养的细胞设为空白对照组，用眼镜蛇毒神经生长因子进行干预（干预浓度依次为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）的细胞设为实验组；（3）双向电泳实验分组：用单纯培养基培养的细胞设为空白对照组，用眼镜蛇毒神经生长因子进行干预（干预浓度依次为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）的细胞设为实验组。方法：（1）眼镜蛇毒NGF通过ShephadexG-75凝胶柱和CMSepharoseCL-6B离子胶柱二步色谱法进行分离纯化；（2）各洗脱峰的生物学活性用PC12细胞测定，具有NGF生物学活性的洗脱峰纯度和相对分子质量用SDS-PAGE电泳方法鉴定；（3）采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖是否受蛇毒NGF的影响；（4）采用流式细胞术检测HSC-T6细胞的凋亡是否受蛇毒NGF的影响；（5）采用双向电泳的方法探究HSC-T6细胞蛋白质表达在蛇毒NGF干预前后是否存在差异；（6）对双向凝胶电泳中差异表达在1.8倍及以上的蛋白质点采用质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行鉴定；（7）对鉴定出的表达具有差异的蛋白质点，利用生物信息学手段进行分析（蛋白质-蛋白质相互作用、GO分类及STRING网络）；（8）蛋白质印迹法（WesternBlot，WB）对差异的蛋白质点进行验证。结果：（1）眼镜蛇毒粗毒经ShephadexG-75凝胶柱粗分离得到3个峰，第二峰峰尖具有NGF活性；具有NGF活性的第二峰经过CMSepharoseCL-6B离子胶柱再分离得到5个峰；（2）将上述各个峰分别作用于PC12细胞，结果显示具有明显神经生长因子活性的是第Ⅲ峰。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对分离的神经蛇毒生长因子进行检测为电泳纯，其分子量经计算得22.3KD；（3）MTT实验结果表明蛇毒神经生长因子对HSC-T6细胞的增殖有明显的抑制作用：NGF浓度为1μg/ml时的抑制率为（25.1±2.1）%，浓度为5μg/ml时的抑制率为（48.2±1.9）%，明显高于对照组的抑制率（23.8±1.8）%，差异具有统计学意义（P0.05）；（4）在流式细胞术实验中通过检测发现蛇毒生长因子能够诱导HSC-T6细胞发生凋亡：在NGF浓度为2μg/ml时的凋亡率为（16.16±3.02）%，5μg/ml时的凋亡率为（22.15±3.31）%，10μg/ml时的凋亡率为（31.28±2.16）%，明显高于对照组的凋亡率（4.36±1.85）%，差异具有统计学意义（P0.05）；（5）空白对照组和被蛇毒NGF干预的双向电泳图谱经比对分析后，共47个蛋白质点有表达差异，有22个在蛇毒神经生长因子干预组上表达增加，另有25个表达减少；随着NGF浓度的变化，一些差异蛋白质的表达也随之变化；（6）对上述表达差异在1.8倍及以上的共18个蛋白质点，，利用质谱技术进行肽质量指纹图谱(PMF)进行分析，鉴定出13个蛋白质；（7）对这些差异蛋白质利用生物信息学的手段进行分析，发现在细胞分化增殖、信号传导通路、细胞氧化代谢、生物调节等过程起着十分重要的作用；（8）蛋白质印记法结果显示：TGF-β蛋白质在对照组高表达，被NGF干预后，其表达能力随着神经生长因子浓度的增加而逐渐降低，呈负相关；与此同时，RHOA蛋白质在神经生长因子干预的条件下的表达增加，并且随着神经生长因子浓度的增大而逐渐增大，呈正相关。结论: （1）具有生物活性的神经生长因子能够从眼镜蛇毒中分离纯化得到；（2）蛇毒神经生长因子对HSC-T6细胞的增殖起到明显的抑制作用；（3）蛇毒神经生长因子对HSC-T6细胞的凋亡具有诱导作用；（4）蛇毒神经生长因子能使HSC-T6细胞蛋白质发生差异性表达；（5）发生差异性表达的蛋白质应该是在肝纤维化过程中的关键因素，这些蛋白质能够通过信号转导通路参与生物调节，可能通过这种方式来实现抗肝纤维化的目的。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2

【参考文献】