TLR4-snail信号通路在LPS诱导的人胆管上皮细胞EMT中作用初步研究

发布时间：2019-02-09 12:16

【摘要】：目的:胆管病(Cholangiopathies)泛指以胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)为主要攻击靶点的一类疾病,其本质是胆管上皮细胞受损后,上皮化的功能单位发生改建和纤维化。研究表明胆管纤维化常伴随胆道的慢性感染。Toll样受体4(Toll-like recepter,TLR4)作为炎症反应调节及细胞信号传导的关键,其本身又是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的天然受体。我们在前期的研究中发现TLR4可参与活化并激活由LPS介导的胆管上皮细胞发生EMT现象,但其具体机制尚有待研究。TLR4是否是BECs发生EMT的关键节点,以及下调TLR4能否抑制EMT,从而阻止胆道纤维化的发展?这一问题已成为研究的热点。本研究旨在通过针对人胆管上皮细胞(human biliary epithelial cell lines,HIBEip C)TLR4的小干扰RNA病毒载体(LV-TLR4-RNAi),体外对HIBEpi C进行转染实验,降低TLR4 m RNA表达,观察LPS介导的EMT逆转情况。探讨LPS介导的EMT过程中,TLR4可能扮演的角色,以及核转录因子snail在EMT中可能发挥的调控作用。以期为以胆管纤维化为主要特点的胆道疾病的临床药物治疗寻找新的靶点,和提供新的思路。方法:将购买的人胆管上皮细胞株(human biliary epithelial cell lines,HIBEpi C)进行培养后,分别设立①control组(未感染任何病毒的正常细胞组);②control+LPS组(LPS诱导未感染病毒细胞组);③NC+LPS组(negative control+LPS,LPS诱导阴性对照病毒感染组)进行实验;④KD+LPS组(knock down+LPS,LPS诱导RNAi靶点病毒感染组)。②组将正常HIBEpi C与LPS共同培养;④组将TLR4的小干扰RNA病毒载体LV-TLR4-RNAi转染至正常HIBEpi C,收集感染率80%的细胞与LPS共同培养;③组用阴性病毒CON077相同步骤进行细胞转染和LPS刺激。分别取0h、14h、24h、48h和72h等不同时相点,通过荧光定量PCR检测转染前后,胆管上皮细胞E-cadherin、TLR4和snail m RNA水平表达变化情况。①、②、③、④组分别进行两两比较,结果用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,P0.05表示有统计学差异。结果:1.LPS诱导正常HIBEpi C,14h、24h、48h、72h后细胞间排列变得松散,细胞呈现长梭形改变,细胞突起增多。随诱导时间延长,细胞形态越接近成纤维细胞样形态。而刺激慢病毒转染后的HIBEpi C,相同时相观察细胞接近正常上皮样细胞形态,细胞大小基本一致,细胞形态各异,呈圆形、椭圆形、多边形等。提示:TLR4-si RNA可抑制LPS诱导的HIBEpi C发生EMT。2.LPS刺激HIBEpi C后14h即可检测到TLR4 m RNA表达量较正常HIBEpi C明显升高(P0.01),随培养时间延长,一直维持在较高水平。而④组经LV-TLR4-RNAi病毒转染的HIBEpi C,在LPS刺激下可检测到TLR4 m RNA表达下降,0h、14h、24h、48h和72h敲减效率分别为73.5%、81.5%、89.9%、93.9%和82.6%;LPS刺激TLR4-si RNA后的HIBEpi C,0h即出现TLR4 m RNA表达量较③组明显下降,至72h未见升高趋势(P0.01)。结果说明病毒转染成功,TLR4-si RNA可特异性沉默TLR4m RNA表达。3.LPS刺激HIBEpi C,14h后可观察到锌指转录因子snail较正常细胞的表达量升高,继续培养至24h、48h,其表达仍维持较高水平(P0.01)。同样与③组比较,TLR4-si RNA的HIBEpi C,snail的表达随培养时间的延长,表达量降低,14h、24h、48h最明显(P0.01)。说明TLR4-si RNA可下调snail在HIBEpi C上的表达。4.LPS刺激可诱导HIBEpi C发生EMT现象,主要表现为上皮标志物E-cadherin在转录水平受到明显抑制,②组经LPS刺激,14h起至72h内,可观察到E-cadherin表达持续下降(P0.01)。而在TLR4-si RNA干扰后,与③组间比较,TLR4被阻断14~48h均能检测到E-cadherin的表达量出现上调(P0.01)。说明TLR4-si RNA干扰后可抑制E-cadherin下调。5.LPS刺激阴性对照病毒转染后的HIBEpi C,各时相点检测到的EMT相关目的基因表达情况与②组表达情况基本相符,P0.05差异无统计学意义。说明病毒载体本身对本实验结果无影响。结论：1.通过RNA干扰技术沉默TLR4基因表达,可有效抑制LPS诱导的胆管上皮细胞发生EMT表型转化;2.沉默TLR4的HIBEpi C中,上皮标志物明显升高,EMT现象受到了明显的抑制;3.转录因子snail是EMT过程中重要的信号分子,在模拟的胆道感染的微环境中,其表达也受到TLR4的调控;4.TLR4可作为早期调控胆管上皮细胞EMT、抑制胆道纤维化进程的药物治疗靶点,对胆道结石、胆道感染所致的胆管纤维化防治有重要的潜在治疗前景。
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【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.7

【参考文献】