【摘要】：在人类中,Notch信号通路有五个配体(Jagged1,Jagged2,Delta-like配体1(D111),D113和Dll4). Notch受体和配体在各种人体组织里都有表达,其中也包括肝脏组织。Alagille综合征是一种小叶间胆管发育不良的累及多系统的显性遗传性疾病,Jagged1基因突变被证实是导致Alagille综合征的病因。但是有趣的是,Alagille综合征患者不会发展成明显的纤维化。此外,在病变肝脏的新生小血管和胆管中发现Jagged1和Notch3过表达,例如原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC).这些研究表明,Notch信号通路可能通过参与新生异常血管和胆道反应,与门脉周围纤维化过程相关。然而,Notch配体在肝纤维化进展中的作用仍不清晰。 第一部分Notch信号通路在慢性HBV感染患者中的表达变化 方法(1)为了探讨Notch受体和配体的表达水平与肝纤维化形成机制的关联性,采用免疫组化检测10例HBV感染后肝硬化的肝组织和5例对照组的肝组织中的Notch配体(Jagged1, Jagged2, Dll1, D113和D114)和受体(Notch1,2,3和4)表达情况。在肝纤维化激活的肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)和肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFBs)的关键机制中,需要进一步明确Notch受体和配体是否存在于激活的HSCs和MFBs中。通过双染技术研究Notch受体／配体和a-平滑肌肌动蛋白(α-SMA,激活的HSCs或者MFBs标记物)。(2)为了判断Notch信号通路和肝脏疾病严重程度的相关性,通过免疫组化显示113例HBV感染患者的肝脏组织的D114和Notch1的表达水平。 结果(1)免疫组化显示在HBV感染后肝硬化的肝组织中Notch配体Jagged1,D113和D114以及受体Notchl,2,3和4呈强阳性染色,然而在对照组的肝组织中呈低表达或无表达。在这些已知的Notch受体和配体中,Jaggedl, D114和Notchl在肝窦细胞中呈阳性染色。共聚焦显微镜显示表明在肝硬化组织的激活的HSCs和MFBs中强烈表达D114和Notch1。(2)在非肝硬化的HBV感染患者中,Notch1染色阳性主要集中在胆管上皮细胞。然而,有趣的是,仅有HBV感染的肝硬化患者,Notch1染色阳性表达在肝窦细胞中。进一步评估不同疾病程度的HBV感染患者中肝窦细胞和汇管区的Notch1和D114的表达水平显示,D114的免疫组化评分与炎症分级(r=0.6,p0.0001)以及纤维化分级(r=0.68,p0.0001)呈显著相关性。这些结果表明,在HBV慢性感染中,D114可能与炎症和／或纤维化呈相关性。 结论(1)慢性HBV感染的肝硬化患者中,Notch配体D114和受体Notchl在激活的HSCs和MFBs中明显表达。(2)在113例HBV感染患者中,D114的免疫组化评分与炎症分级以及纤维化分级呈显著相关性。 第二部分rD114的体内注射对CCh诱导的小鼠肝纤维化模型的影响 方法将18只C57BL/6小鼠按照体重随机分为3组(每组6只)：空白组、CC14组和CCl4+rD114组。在CC14组,腹腔内注射CCl4(0.5ml/kg,按1：4稀释于橄榄油中,每周注射两次),连续4周。在CCl4+rD114组,腹腔内注射CC14的同时,每周两次注射6.25μg的rD114,连续4周。在空白组,腹腔内仅注射与CC14组同等剂量的橄榄油。在最后一次腹腔内注射CC14后,留取全血标本并颈椎脱臼处死小鼠。 结果(1)rD114的注射显著的升高了肝脏Hes1和Hes5的mRNAs(Notch信号通路的直接的两个靶基因)的表达水平,这表明在肝脏中Notch信号通路被rD114激活。在rD114治疗后,CC14诱导的小鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)水平明显下降。组织学上,rD114治疗后显著降低肝脏纤维化和肝脏中α-SMA阳性细胞水平。与病理组织学结果一致,实时定量PCR显示rD114治疗显著降低CC14诱导的肝脏胶原蛋白1a1和α-SMA的mRNA的表达水平。此外,rD114治疗后,CC14诱导的羟脯氨酸含量也明显下降。(2)除了纤维化相关指标以外,进一步评估rD114对CC14诱导的小鼠肝脏炎症的影响。HE染色显示rD114治疗显著降低CC14诱导的小鼠肝脏炎症。通过实时定量PCR比较检测rD114治疗与非治疗CC14诱导的小鼠肝脏中一系列炎症相关的细胞因子,包括TNF-α, IFN-γ,IL-1α,IL-2, IL-4, IL-6, IL-10,IL-12a,IL-13和TGF-β1。rD114的治疗显著抑制了CCl4诱导的TNF-α,IL-6,IL-10和IFN-y的mRNA表达水平(P0.05),而对IL-1α和IL-12α的mRNA的表达水平并没有明显的影响(p0.05)。另外,两组中IL-2,IL-4和IL-13的mRNA表达水平都非常低。接着,进一步探讨rD114对炎症细胞浸润的影响。F4/80,S100A4和CD45分别是巨噬细胞,成纤维细胞和非巨噬细胞的炎症细胞的标记物。免疫组化分析表明CCl4诱导的这三种炎症细胞随着rD114的治疗明显下降。另外,rD114的治疗不能改变TGF-p1的mRNA的表达水平,但是,可以导致了p-Smad2表达水平的下降(TGF-β信号通路激活的标记物)。这些结果表明rD114可能直接通过抑制炎症反应从而改善CC14诱导的肝纤维化模型。 结论体内注射rD114蛋白可明显改善四氯化碳诱导小鼠的肝损伤,炎症和纤维化程度。 第三部分rD114处理培养的HSCs对其纤维化相关因子的影响 方法(1)通过使用GSI(一种Notch信号通路抑制剂),评估Notch信号通路在体外大鼠原代HSCs和纤维化贮脂细胞(cirrhotic fat storing cells, CFSCs)中的作用。另外,应用Adeasy cloning系统(Quantum, Heidelberg, Germany)获得(CAGA)9-MLP-Luc的重组腺病毒,CFSCs高度增殖感染后,通过1β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白标记重组病毒进行评估。一般的,90%以上的CFSCs被感染。24小时后弃去培养基,感染后将感染细胞培养于无血清但含0.5%FCS的DMEM培养基过夜和第二天进行刺激。(2)接着,探讨培养的HSCs和CFSCs中D114的影响。rD114处理原代大鼠HSCs和CFSCs,进一步检测纤维化相关因子水平。另外,在CFSCs中采用RNAi技术阻断D114：转染前一天,细胞接种在24孔板上,0.5mL含FBS和抗生素的DMEM细胞培养基；选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%；在50μL的DMEM无血清培养基加入20pmo1siRNA,柔和混匀；混匀SiMi Transfection Reagents试剂,用50μL无血清的DMEM稀释1μL SiMi Transfection Reagents试剂,轻轻混匀,室温放置5分钟；将稀释好的siRNA和SiMi Transfection Reagents试剂混合；轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents复合物；将100μL siRNA/SiMi Transfection Reagents复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板；细胞在C02培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。 结果(1)在原代HSCs中GSI的处理降低了胶原蛋白I的mRNA的基础水平,也抑制了TGF-β介导的胶原蛋白I的mRNA的上调。在CFSCs中,GSI的治疗可以阻止TGF-β介导的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF),α-SMA和胶原蛋白1α1l蛋白的上调。而且,GSI的处理显示GSI对TGF-p诱导的Ad(CAGA)9-MLPLuc受体基因激活的显著抑制效果,这表明Notch信号通路的阻断可以影响经典的TGF-β信号转导。在GSI存在情况下,IL-13刺激α-SMA蛋白表达可以被完全阻断。这些结果表明,Notch信号通路促进HSCs中促纤维化基因的表达。(2)rD114处理原代大鼠HSCs,发现可以抑制TGF-β诱导胶原蛋白lal的mRNA的表达,但是无论在大鼠还是小鼠HSCs中不能影响α-SMA的mRNA的表达。在蛋白水平,在CFSCs中,rD114的处理降低了TGF-β诱导的CTGF的表达,但是对α-SMA蛋白的表达没有影响。在CFSCs中采用RNAi技术阻断D114导致增强了TGF-β依赖的CTGF的表达,然而并没有影响α-SMA的表达水平。 结论(1)Notch信号通路的阻断可以影响经典的TGF-p信号转导。(2)Notch信号通路促进HSCs中促纤维化基因的表达。(3)体外rDll4处理培养的HSCs,发现可抑制TGF-β诱导的Ⅰ型胶原和CTGF的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2
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本文编号：
2455928
