PINK1介导的线粒体自噬障碍在NASH发病机制中的作用

发布时间：2019-05-12 20:08

【摘要】：目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常见的慢性肝脏疾病之一,可分为单纯性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及肝硬化,其中NASH是NAFLD疾病进程中的关键环节,但NASH的发病机制尚不明确。最新研究证实,线粒体功能障碍,可诱导NLRP3炎症小体活化,加重炎症反应,而PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除受损线粒体的经典途径之一。本研究旨在通过检测PINK1-Parkin介导的线粒体自噬水平,探讨线粒体自噬对NASH病情演变过程中NLRP3依赖性炎症反应的影响。方法:采用胆碱蛋氨酸缺乏(Methionine-choline deficient diet,MCD)饮食构建小鼠NASH模型,其对照组喂食胆碱蛋氨酸含量充足(Methionine-Choline sufficient diet,MCS)的饲料。检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transam inase,AST)、总超氧化物歧化酶(Total-superoxide dismutase,T-SOD)、丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、过氧化氢(H2O2)水平;部分肝组织石蜡包埋后切片,用于苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色、油红O染色观察肝脏病理变化;余肝组织经液氮速冻后,-80℃冰箱保存,用于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测肝组织PINK1、Parkin、NLRP3、caspase 1、ASC、IL1β、IL18 mRNA表达,Western blot检测肝组织LC3Ⅱ、P62、PINK1、Parkin、NLRP3的表达。结果:1成功构建小鼠NASH模型实验结果可见0周组小鼠体毛整齐有光泽,体重正常,活动度正常,精神良好,进食正常;MCS 4周组及MCS 8周组小鼠体毛整齐有光泽,体重增加,活动正常,精神良好,进食正常;MCD 4周组小鼠体毛凌乱、无光泽,体重减轻,活动减弱,精神欠佳,进食减少;mcd8周组小鼠的体毛凌乱、无光泽,体重明显减轻,活动减弱,精神萎靡,进食量明显下降。小鼠体质量、肝指数比较:与0周组及mcs对照组相比,mcd模型组小鼠的体重均明显降低(p0.01),但mcd8周组体重与mcd4周组相比差异无统计学意义;mcd8周组小鼠肝指数较0周组、mcd4周组及mcs8周组升高(p0.05),差异有统计学意义。2小鼠血清生化指标与0周组及mcs对照组相比,mcd模型组小鼠血清alt、ast水平均明显升高(p0.01),且mcd8周组alt、ast水平较mcd4周组升高(p0.05),差异具有统计学意义。3肝脏大体标本的观察0周组及mcs4周组小鼠肝脏呈深红色,有光泽,质软,边缘锐利,密度正常;mcd4周组小鼠肝脏体积增大、呈淡黄色、可见组织间充盈淡黄色脂肪斑点、边缘变钝;mcs8周组小鼠肝脏呈淡红色、有光泽、偶见组织间有淡黄色脂肪斑点、边缘锐利;mcd8周组小鼠肝脏体积增大、呈黄色、可见黄色脂肪斑,密度降低、边缘钝。4肝组织病理学改变he染色结果显示:0周组及mcs4周组:肝小叶结构清晰,以中央静脉为中心,肝细胞索呈放射状排列,肝细胞结构完整,大小均匀,无变性、坏死及炎细胞浸润;mcd4周组:大量肝细胞内存在脂肪空泡,部分区域出现肝索结构紊乱,可见炎细胞浸润;mcs8周组:偶见散在的脂质沉积和脂肪变,但无大泡样改变及炎细胞浸润;mcd8周组:肝细胞内充满大量大小不一的脂肪空泡,肝细胞结构紊乱呈气球样变,大量炎细胞浸润,呈灶状分布,以单核细胞、淋巴细胞为主。masson染色结果显示:0周组及mcs4周组:肝小叶结构完整,除汇管区内有胶原纤维染色外,未见有胶原纤维;mcd4周组:肝小叶结构尚存,纤维局限于汇管区,细胞呈长梭形,窦周隙内少量胶原纤维增生;mcs8周组:肝小叶结构完整,汇管区及窦周隙可见少量胶原纤维增生;mcd8周组:肝小叶结构紊乱,小叶中央有胶原纤维存在,可见明显的肝细胞坏死及纤维组织增生,增生的胶原纤维分布于窦周隙内。油红o染色结果显示:0周组及mcs4周组小鼠肝组织未见红色脂滴;mcd4周组小鼠肝组织可见大量红色脂滴,肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为40~65%;mcs8周组可见少量散在红色脂滴,成小颗粒状,肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为3~10%;mcd8周组小鼠肝组织可见大量红色脂滴,部分融合成片,肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为65~90%。肝组织病理nas评分:mcd4周组及mcd8周组肝组织评分较0周组、mcs对照组显著升高(p0.05),总分5分,符合nash组织学诊断。5小鼠血清sod、mda、h2o2水平与0周组及mcs对照组相比,mcd模型组小鼠血清mda、h2o2水平均升高,sod水平降低(p0.05);且mcd8周组h2o2水平较mcd4周组升高,而sod水平较mcd4周组降低(p均0.05)。6肝组织pink1、parkin、nlrp3、caspase1、asc、il1β、il18mrna的表达rt-qpcr结果显示:与0周组及mcs对照组相比,mcd模型组小鼠肝组织nlrp3、caspase1、asc、il1β、il18mrna表达水平均明显升高,parkinmrna表达水平降低,且mcd8周组与mcd4周组相比差异有统计学意义(p0.05);mcd8周组小鼠肝组织pink1mrna表达较0周组、mcd4周组及mcs8周组均明显升高(p均0.05)。7肝组织lc3Ⅱ、p62、pink1、parkin、nlrp3蛋白的表达westernblot结果显示:与0周组及mcs对照组相比,mcd模型组小鼠肝组织pink1、parkin蛋白表达均降低、nlrp3蛋白表达升高,且mcd8周组与mcd4周组相比差异有统计学意义(p均0.05);lc3Ⅱ蛋白表达在mcd4周组较0周组、mcs4周组升高,而在mcd8周组降低(p均0.05);p62蛋白表达在mcd8周组较0周组、mcd4周组及mcs8周组均明显升高(p均0.05),差异具有统计学意义。8nash小鼠肝组织pink1与nlrp3相关性分析nash小鼠肝组织pink1与nlrp3呈负相关,相关系数为r=-0.821(p0.01)。结论:1 PINK1-Parkin介导的线粒体自噬参与了NASH的病理过程。2线粒体自噬功能障碍,可能通过上调ROS,激活NLRP3炎症小体,促进NASH疾病进展。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.5

【参考文献】