锌alpha2糖蛋白对棕榈酸诱导的HepG2细胞内TG沉积的影响

发布时间：2019-06-13 10:23

【摘要】：目的:观察棕榈酸(palmitic acid,PA)对Hep G2和Hepa1-6细胞中锌alpha2糖蛋白(Zinc alpha2 glycoprotein,ZAG)及法尼酯受体(Farnesoid X receptor,FXR)表达的影响以及探讨Hep G2细胞过表达ZAG后对棕榈酸诱导的TG沉积的影响。方法:1.体外培养Hep G2和Hepa1-6细胞,用浓度分别为0m M、0.2m M、0.4m M、0.6m M的棕榈酸分别干预Hep G2和Hepa1-6细胞24小时,Western blot在蛋白水平检测ZAG及FXR表达。2.用六孔板体外培养Hep G2细胞,用过表达ZAG质粒和空质粒经脂质体2000转染Hep G2细胞24h后,0.4m M棕榈酸干预24h,采用酶联免疫法检测细胞内甘油三酯的水平,油红O染色观察细胞内脂滴,Western blot在蛋白水平检测代谢性核受体(FXR、PPARα、LXR和SREBP1c)、脂肪酸合成(FAS、ACC、SCD-1等)、脂肪酸摄取(FATP4)、脂肪酸β-氧化(CPT1A)、脂联素(Adiponectin)等基因表达。结果:1.随着棕榈酸浓度的增加,Hep G2和Hepa1-6细胞ZAG蛋白表达水平逐渐减少(P0.01),且PA浓度为0.6m M时,其表达水平最低;此外,FXR蛋白表达水平也均降低,PA浓度为0.4m M时,Hep G2细胞FXR蛋白表达水平明显降低(P0.01),PA浓度为0.6m M时,Hepa1-6细胞FXR蛋白表达水平明显降低(P0.01)。2.油红O染色显示,在棕榈酸干预下,与对照组相比较,过表达ZAG组的Hep G2细胞内橘红色脂滴明显减少;细胞内甘油三酯测定显示,与对照组相比较,过表达ZAG组的Hep G2细胞内甘油三酯含量减少。3.与p IRES2-GFP组相比,p IRES2-h ZAG组ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表达增加(p0.05),SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1表达降低(p0.01),FATP表达无明显差异(p0.05),p IRES2-GFP+PA组ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα表达降低(p0.01),SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP、CPT1A表达增加(p0.01);与p IRES2-GFP+PA组相比,p IRES2-h ZAG+PA组ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表达增加(p0.01),SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP表达降低(p0.01)。结论:1.过表ZAG能减少棕榈酸诱导的Hep G2细胞内甘油三酯的沉积。2.过表ZAG可通过增加代谢性核受体FXR、PPARα的表达和降低LXR、SREBP1c的表达,使脂肪酸合成基因FAS、SCD-1、ACC及脂肪酸转运基因FATP4的表达降低,脂肪酸β氧化基因CPT1A的表达增加,从而减少Hep G2细胞内甘油三酯的沉积。目的:构建沉默ZAG的RNAi慢病毒载体,感染Hep G2细胞,观察感染病毒的Hep G2细胞在棕榈酸诱导下甘油三酯沉积的变化。方法:1.用三条不同序列的LV-AZGP1-RNAi和LV-GFP-RNAi病毒分别感染Hep G2细胞,MOI=10,RT-q PCR筛选最佳沉默效果的LV-AZGP1-RNAi病毒。2.用上述沉默效果最佳的LV-AZGP1-RNAi病毒感染Hep G2细胞,MOI=10,感染72小时后,用0.4m M棕榈酸干预细胞24小时,采用酶联免疫法检测细胞内甘油三酯的水平,油红O染色观察细胞内脂滴,Western blot在蛋白水平检测代谢性核受体(FXR、PPARα、LXR和SREBP1c)、脂肪酸合成(FAS、ACC、SCD-1等)、脂肪酸摄取(FATP4)、脂肪酸β-氧化(CPT1A)、脂联素(Adiponectin)等基因表达。结果:1.RT-q PCR结果显示:在Hep G2细胞中,相对于LV-GFP-RNAi组,LV-AZGP1-RNAi-1组、LV-AZGP1-RNAi-2组及LV-AZGP1-RNA-3组AZGP1基因敲减效率都70%(P0.01),其中LV-AZGP1-RNAi-2组沉默效果最佳。2.油红O染色显示,在棕榈酸干预下,与对照组相比较,沉默ZAG组的Hep G2细胞内橘红色脂滴明显增加;细胞内甘油三酯测定显示,与对照组相比较,沉默ZAG组的Hep G2细胞内甘油三酯含量增加。3.与LV-GFP-RNAi组相比,LV-AZGP1-RNAi组ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表达降低(P0.05),SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1表达增加(P0.01),FATP表达无明显变化(P0.05),LV-GFP-RNAi+PA组ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα表达降低(P0.01),SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP、CPT1A表达增加(P0.01);与LV-GFP-RNAi+PA组相比,LV-AZGP1-RNAi+PA组ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表达降低(P0.01),SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP表达增加(P0.01)。结论:1.沉默ZAG能增加棕榈酸诱导的Hep G2细胞内甘油三酯的沉积。2.沉默ZAG可通过降低代谢性核受体FXR、PPARα的表达和增加LXR、SREBP-1c的表达,使脂肪酸合成基因FAS、SCD-1、ACC及脂肪酸转运基因FATP4的表达增加,脂肪酸β氧化基因CPT1A的表达降低,从而增加Hep G2细胞内甘油三酯的沉积。
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【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5

【参考文献】