Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立

发布时间：2017-03-14 10:32

  本文关键词：Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立，由笔耕文化传播整理发布。

《扬州大学》 2014年

Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立

朱嘉磊  

【摘要】：戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)感染引起的病毒性肝炎症,具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,其临床症状与甲型肝炎相似。急性戊型肝炎患者一般发病期为3至4周左右,期间除了体内转氨酶水平升高之外,一般不产生明显的并发症。但研究也表明,急性戊型肝炎对孕妇具有威胁。孕妇在妊娠期内,感染急性戊型肝炎的概率要大于其他人群,因其导致的流产率接近20%。免疫力低下的患者感染HEV后能够发展为慢性戊型肝炎。有些慢性戊型肝患者因肝脏快速纤维化而出现肝硬化,并最终导致肝功能衰退甚至肝脏衰竭。 现有的研究已发现,戊型肝炎病毒共分为4种基因型,其中Ⅳ型HEV能普遍感染人和牲畜,在卫生条件差或饮水问题严重的地区极易大规模爆发和流行,对社会造成巨大和健康隐患和经济损失。为了对Ⅳ型HEV更好的进行检测和生物学活性研究,本文做了两方面的研究： 研究一根据GenBank收录的多株Ⅳ型猪HEV ORF2保守基因序列,设计一对特异性引物,建立起一套Ⅳ型HEV SYBR Green Real-time RT-PCR方法,并对其稳定性,特异性及灵敏度做了相关分析,同时与常规的巢式PCR(或称nested-RT-PCR)进行比较。结果显示,建立的标准曲线相关系数(R2)、组内重复性Ct值变异系数(CV%)和组间重复性Ct值变异系数(CV%)均符合要求,显示该方法具有良好的稳定性。且与传统的巢式PCR相比,本研究所建立的荧光定量PCR方法能更好的运用于对Ⅳ型猪HEV的检测和定量研究。 研究二为获得单一的、高纯度的Ⅳ型猪HEV病毒液,本研究将猪戊型肝炎急性期内的Ⅳ型HEV阳性粪便悬液经快速离心和过滤后感染人肝癌细胞(smmc-7721),进行病毒毒株的纯化与扩增,成功的建立起一套稳定的Ⅳ型猪HEV体外细胞培养体系。接种阳性粪便悬液的细胞在接毒后发生大量凋亡并裂解,并发现人肝癌smmc-7721细胞系支持Ⅳ型猪HEV的增值。对不同初始病毒接种量下HEV的增值趋势分析显示,在一定条件和范围内,HEV初始接种量越大,病毒的增值速度越快,增值效率也越高。此外对Ⅳ型猪HEV毒株进行了7次持续的传代培养,细胞上清液中HEV的拷贝量最高可在接毒后第72天增值至2.05×107copies/mL。与传统的HEV体外细胞培养体系相比,本研究根据人肝癌smmc-7721细胞所建立的体外培养体系能更好的应用于对Ⅳ型猪HEV进行大量的、持续的培养。 通过本研究,初步构建起一套较为稳定的Ⅳ型猪HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系,能在检测对Ⅳ型猪HEV进行检测的同时,对HEV在smmc-7721细胞中的增值进行较为准确的定量。本研究对戊型肝炎的检测与防治具有积极的意义,也利于对在分子水平对HEV展开进一步的研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.6
【目录】：

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 葛胜祥,田克恭,多海刚,李纯玲,陈凡,王传彬,彭耿,夏宁邵;中国不同地区商品猪中戊型肝炎病毒感染情况调查[J];中国人兽共患病杂志;2003年02期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张健,宣世英;戊型肝炎研究现状[J];青岛医药卫生;1997年07期

2 王凤阳;李布勇;王轶;廖起志;杜丽;李笑春;申明霞;成鹰;刘涛;;海口和三亚地区商品猪中戊型肝炎病毒感染情况调查[J];中国热带医学;2007年06期

3 王凤阳;杜丽;张莉娜;;猪戊型肝炎病毒的研究进展[J];中国热带医学;2007年06期

4 周锦萍;刘佩红;张维谊;刘健;鞠厚斌;沈莉萍;李凯航;;上海地区猪群中戊型肝炎病毒的流行情况[J];上海交通大学学报(农业科学版);2009年04期

5 朱奕奕;李燕婷;张爱香;周研;沈荣明;沈微娟;;上海地区猪戊型肝炎感染状况及病毒序列分析[J];上海预防医学杂志;2006年03期

6 张潇,郑英杰,王法弟,高眉扬,朱建福,姜庆五;浙江省某农村地区猪粪便与胆汁中戊型肝炎病毒的检测和部分序列分析[J];复旦学报(医学版);2005年05期

7 陆一涵;宋建根;葛胜祥;姜庆五;王法弟;郭清顺;董晓莲;朱连华;范建良;高眉扬;夏宁邵;郑英杰;;水源因素与戊型肝炎病毒感染的关联性[J];复旦学报(医学版);2007年05期

8 屈勇刚;贾鹏;金宁一;陆民;孙中锋;朱光泽;于芳;刘玉生;夏志平;;猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定[J];中国生物工程杂志;2008年01期

9 崔立;杨志彪;朱建国;华修国;;猪源戊型肝炎病毒研究现状及进展[J];上海畜牧兽医通讯;2006年06期

10 鞠龚讷;孙泉云;葛杰;华修国;;动物戊型肝炎研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2007年05期

中国重要会议论文全文数据库 前8条

1 周锦萍;孙泉云;刘佩红;薛霞;李凯航;卢军;张维谊;齐新永;;上海地区多种动物中戊型肝炎病毒感染状况调查[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集（下册）[C];2006年

2 李震;陆海平;董世娟;朱与敏;;猪戊型肝炎病毒防控及研究策略分析[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

3 张晓峰;帅江冰;董强;朱振江;余招锋;许赢升;邬生力;;浙江省猪戊型肝炎病毒感染状况及其分子流行病学研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

4 周锦萍;刘佩红;张维谊;刘健;鞠厚斌;沈莉萍;李凯航;;采用聚合酶链法调查上海地区猪群中戊型肝炎病毒的流行情况[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

5 帅江冰;张晓峰;李爱云;方维焕;;2005-2008年浙江省生猪主产区猪戊型肝炎血清流行病学调查[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年

6 张雪峰;张军;田华;许可;闫强;夏宁邵;朱凤才;;江苏省部分地区散发戊型肝炎流行病学及病毒基因型研究[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年

7 陆一涵;宋建根;葛胜祥;姜庆五;王法弟;郭清顺;董晓莲;朱连华;范建良;高眉扬;郑英杰;;水源因素与戊型肝炎病毒感染的关联性[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

8 李震;朱于敏;董世娟;周宗清;;戊型肝炎与兽医公共卫生[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 赵钦;国内禽戊型肝炎病毒的分离鉴定及其抗原性的研究[D];山东农业大学;2011年

2 朱光泽;戊型肝炎流行病学和戊型肝炎病毒全基因克隆与表达研究[D];吉林大学;2007年

3 屈勇刚;戊型肝炎病毒流行病学及其感染机理探索研究[D];吉林大学;2008年

4 陆一涵;中国华东地区基因Ⅳ型戊型肝炎病毒人畜共患与进化起源研究[D];复旦大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 董施伟;禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[D];山东农业大学;2010年

2 张西营;猪感染戊肝病毒后体内抗体与抗原相关性及病毒准种现象研究[D];山东农业大学;2010年

3 刘启文;猪戊型肝炎病毒表位的筛选及间接ELISA方法的建立[D];上海师范大学;2011年

4 张序;猪戊型肝炎病毒RT-nPCR方法的建立及SHEV-JX株的分离[D];江西农业大学;2011年

5 曹文兵;新疆羊戊型肝炎血清流行病学调查及HEV ORF2-62基因的克隆表达[D];石河子大学;2009年

6 张帆;猪戊型肝炎病毒WH09株全基因组分析及ORF2单克隆抗体的制备[D];华中农业大学;2011年

7 杨正玉;吉林省吉林市猪戊型肝炎流行病学调查[D];吉林大学;2011年

8 曲立春;新疆地区羊戊型肝炎的血清学调查及病毒的检测[D];新疆农业大学;2006年

9 曾容愚;猪戊型肝炎病毒上海株全基因组测序及上海地区动物抗体检测[D];南京农业大学;2006年

10 彭小兵;HEV猪源株ORF2 C端抗原编码片段的克隆表达及其应用[D];南京农业大学;2006年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 崔立;杨志彪;朱建国;华修国;;猪源戊型肝炎病毒研究现状及进展[J];上海畜牧兽医通讯;2006年06期

2 唐孟萱,周万军,胡元佳,陈卫群,王晓春;HepG2细胞培养方法与条件的探讨[J];实用预防医学;2005年01期

3 葛胜祥,田克恭,多海刚,李纯玲,陈凡,王传彬,彭耿,夏宁邵;中国不同地区商品猪中戊型肝炎病毒感染情况调查[J];中国人兽共患病杂志;2003年02期

4 张晓峰;帅江冰;李爱云;方维焕;何永强;吴珊;;猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其分子流行病学[J];中国兽医学报;2011年06期

《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 大众知识服务
京ICP证040441号
互联网出版许可证 新出网证（京）字008号
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号

订购热线：400-819-9993 010-62982499
服务热线：010-62985026 010-62791813
在线咨询：
传真：010-62780361
京公网安备11010802020475号

  本文关键词：Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：250818