自身免疫性肝炎患者肠屏障功能的变化及意义

发布时间：2019-07-12 14:39

【摘要】：目的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是慢性自身免疫性疾病,由于免疫紊乱导致免疫系统攻击自身肝细胞所致。其发病机制尚不清楚,遗传易感性和环境因素是目前较为公认的发病因素。肠道与肝脏有共同的胚胎起源,肠黏膜淋巴细胞具有防御病原体的作用,肝脏免疫细胞可防止肠道来源的抗原与毒素刺激。肠道黏膜屏障包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障和化学屏障,作为机体重要防线阻止肠腔内细菌毒素进入。大部分肝硬化患者伴有不同程度肠道黏膜屏障功能受损,门脉高压使胃肠道缺血缺氧,肠黏膜产生的炎性介质和氧自由基增多使黏膜上皮紧密连接破坏,肠道黏膜通透性增加。本研究通过深入分析肝硬化与非肝硬化AIH患者肠道机械屏障和免疫屏障的变化情况,旨在探索肠黏膜屏障破坏与肝脏免疫性损伤的相关性,进一步分析肠-肝循环在AIH发病及疾病进展中的作用与因果关系。此外,我们通过评价AIH患者肝脏巨噬细胞活化状态,分析其免疫活动度与肝细胞损伤程度的关系及TLR4蛋白与肝脏巨噬细胞共表达情况,提出肠源性脂多糖通过TLR4途径激活巨噬细胞表达,刺激肝脏免疫异常的假设。方法第一部分:AIH患者肠道机械屏障和免疫屏障的变化收集2016年1月至2016年12月就诊于天津医科大学总医院消化科AIH患者60例(无肝硬化者35例、肝硬化者25例)和健康对照15例,收集外周血标本,对三组受试者应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)测定血清D-Lac、DAO含量;收集2016年1月至2016年12月就诊于天津医科大学总医院消化科AIH患者14例(无肝硬化者6例、肝硬化者8例)和健康对照10例,收集回肠末端黏膜组织标本,应用Realtime-PCR检测ZO-1、Occludin、TLR4及炎症因子表达,应用免疫组化法检测回肠末端黏膜组织巨噬细胞情况,应用Western blot检测s Ig A蛋白表达水平的差异以评价肠黏膜机械屏障和免疫屏障的改变。第二部分:AIH患者肝脏巨噬细胞活化状态的研究收集2016年1月至2016年12月于天津医科大学总医院消化科确诊为AIH患者13例(肝功能正常者5例、肝功能异常者8例)和对照者6例。AIH患者通过超声引导下肝穿刺活检术取得肝脏病理标本,对照者肝组织为胰腺癌或胆管癌手术切除的部分正常肝脏标本。应用免疫组化方法标记肝组织巨噬细胞,以评价肝脏巨噬细胞表达与炎症活动度的关系。进一步通过免疫荧光双染观察肝脏巨噬细胞和Toll样受体4共表达情况,评价其与肝脏炎症活动度的相关性。结果第一部分:AIH患者肠道机械屏障和免疫屏障的变化1.AIH肝硬化患者回肠末端组织部分腺体结构破坏,黏膜微绒毛结构受损,局部可见少量隐窝脓肿形成;无肝硬化AIH患者较健康对照组相比肠黏膜形态欠规整,局部见轻度炎细胞浸润。2.ELISA法比较血清D-Lac水平,AIH患者均有升高[无肝硬化组:(386.1±297.3)μg/L,肝硬化组:(1423.2±409.4)μg/L,健康对照组:(98.6±10.2)μg/L],其中AIH肝硬化患者升高更显著,差异有统计学意义(t=13.049,P0.01);比较血清DAO水平,AIH患者均有升高[无肝硬化组:(6.1±2.3)U/m L,肝硬化组:(11.7±2.7)U/m L,健康对照组:(3.7±1.1)U/m L],AIH肝硬化患者较健康对照组相比升高更显著,差异有统计学意义(t=10.983,P0.01);此外,血清D-Lac、DAO水平均与WBC、Hgb、PLT呈明显负相关(P0.01),且D-Lac与DAO升高水平显著相关(r=0.722,P0.01)。3.Realtime-PCR示AIH患者回肠末端黏膜ZO-1相对表达量均显著低于健康对照组[肝硬化AIH患者vs健康对照组:(0.20±0.14)vs(1.67±0.51),P0.01;无肝硬化AIH患者vs健康对照组:(0.99±0.37)vs(1.67±0.51),P0.05];AIH患者较健康对照组相比Occludin表达量减少,但无肝硬化AIH患者无统计学意义[肝硬化AIH患者vs健康对照组:(0.12±0.09)vs(0.90±0.21),P0.01;无肝硬化AIH患者vs健康对照组:(0.64±0.30)vs(0.90±0.21),P=0.057]。4.CD68免疫组化染色示AIH患者回肠末端黏膜巨噬细胞数量增多:与对照组相比,AIH肝硬化患者每高倍镜视野的绝对计数表达显著增加(P0.05),无肝硬化AIH患者表达增加但差异无统计学意义(P=0.057)。5.Realtime-PCR示AIH患者肠黏膜组织中促炎细胞因子相对高表达:AIH肝硬化患者肠黏膜IL-2、IFN-γ相对表达量均显著高于健康对照组[IL-2:(1.11±0.43)比(0.24±0.16),IFN-γ:(3.50±1.92)比(0.32±0.30),P值均0.01]。无肝硬化AIH患者中,IL-2相对表达量有升高趋势,差异无统计学意义(P=0.1628),而IFN-γ相对表达量的升高无统计学意义(P=0.0622)。抑炎细胞因子相对低表达:AIH患者较健康对照组相比回肠末端黏膜组织IL-10相对表达量均减少[肝硬化AIH患者vs健康对照组:(0.30±0.19)vs(0.74±0.23),P0.05;无肝硬化AIH患者vs健康对照组:(0.42±0.24)vs(0.74±0.23),P0.05],IL-4相对表达量有下降趋势,但差异均无统计学意义[肝硬化AIH患者vs健康对照组:(1.01±0.58)vs(1.45±0.31),P=0.0584;无肝硬化AIH患者vs健康对照组:(1.13±0.54)vs(1.45±0.31),P=0.1548]。6.Realtime-PCR示AIH患者回肠末端黏膜组织TLR4相对表达水平升高,AIH肝硬化患者较对照组相比有显著统计学差异[(6.74±5.13)vs(0.89±0.70),t=3.596,P0.01],无肝硬化AIH患者TLR4表达水平有增加趋势且差异有统计学意义[(3.74±3.65)vs(0.89±0.70),t=2.455,P=0.028]。7.Westernblot检测各组回肠末端黏膜组织s Ig A蛋白表达水平:AIH肝硬化患者s Ig A蛋白水平明显降低(P0.05),而无肝硬化AIH患者s Ig A表达水平有下降趋势但差异无统计学意义(P=0.238)。第二部分:AIH患者肝脏巨噬细胞活化状态的研究1.AIH患者CD68阳性细胞绝对数均显著增多,其中肝酶升高AIH患者CD68表达增加明显(P=0.032),肝酶正常AIH患者巨噬细胞表达数量也增加(P=0.041),CD68在炎性细胞聚集区域表达更为明显。2.免疫荧光双染法标记CD68与TLR4以观察其共表达情况:与健康对照组相比,AIH患者TLR4定位于CD68阳性细胞计数每高倍镜视野明显增多,随着肝酶增高其表达数量存在增加趋势(肝酶正常AIH组:P=0.037,肝酶升高AIH组:P=0.028)。结论1.AIH患者肠道黏膜形态改变,黏膜机械屏障破坏、免疫屏障异常,AIH肝硬化患者较无肝硬化差异更加显著。2.AIH患者巨噬细胞表达增多,TLR4与巨噬细胞共表达,且与肝脏炎症活动度相关。
文内图片：单中心16年回顾性研究自身免疫性肝病首诊临床特点（A）不同类型诊断例数均逐年上升；（B）不同性别患者平均首诊年龄可见明显下降趋势；（C）因体检筛查发现肝功能异常而就诊的无症状患者比例逐年增多；（D）首诊合并肝硬化或影像学出现肝硬化征象

图片说明：图 1 单中心 16 年回顾性研究自身免疫性肝病首诊临床特点（A）不同类型诊断例数均逐年上升；（B）不同性别患者平均首诊年龄可见明显下降趋势；（C）因体检筛查发现肝功能异常而就诊的无症状患者比例逐年增多；（D）首诊合并肝硬化或影像学出现肝硬化征象的患者比例逐年降低。图 2 肠道与肝脏之间双向作用的简化示意图[13]
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图片说明：图 1 单中心 16 年回顾性研究自身免疫性肝病首诊临床特点（A）不同类型诊断例数均逐年上升；（B）不同性别患者平均首诊年龄可见明显下降趋势；（C）因体检筛查发现肝功能异常而就诊的无症状患者比例逐年增多；（D）首诊合并肝硬化或影像学出现肝硬化征象的患者比例逐年降低。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.1

【参考文献】